本品系采用与预防结核病用卡介苗相同的菌种、生产工艺，将高浓度卡介菌经冷冻干燥制成的免疫治疗制剂。 1. 基本要求 生产、检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 卡介苗生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开。所需设备及器具均须单独设置并专用。卡介苗制造、包装及保存过程均须避光。 从事卡介苗制造的工作人员及经常进入卡介苗制造室的人员，必须身体健康，经X射线检查无结核病，且每年经X射线检查1～2次，可疑者应暂离卡介苗的制造。 2. 制造 2.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 2.1.1 名称及来源 釆用卡介菌D2PB302菌株。严禁使用通过动物传代的菌种制造卡介苗。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 2.1.3 种子批的传代 工作种子批启开至菌体收集传代应不超过12代。 2.1.4 种子批的检定 2.1.4.1 鉴别试验 （1）培养特性 卡介菌在苏通培养基上生长良好，培养温度在37～39℃之间。抗酸染色应为阳性。在苏通马铃薯培养基上培养的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌落，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。 （2）多重PCR法 采用多重PCR法检测卡介菌基因组特异性的缺失区RD1，应无RD1序列存在，供试品PCR扩增产物大小应与参考品一致。 多重PCR鉴别试验：采用ET1（5'-AAGCGGTTGC-CGCCGACCGACC-3'）、ET2（5'-CTGGCTATATTCCT-GGGCCCGG-3'）、ET3（5'-GAGGCGATCTGGCGGTTT-GGGG-3'）三条引物，分别以灭菌超纯水稀释至终浓度为10μmol/L。DNA分子量标记物（DNA ladder）为50bp。 取适宜浓度的供试品1ml移入1.5ml EP管中，12000r/min，离心5分钟，弃上清，留40～50μl液体重悬供试品沉淀物，沸水浴10分钟，8000r/min，离心5分钟，取上清作为多重PCR检测模板。 取供试品PCR检测模板5μl，加至45μl反应试剂中［10倍PCR缓冲液（pH8.3 100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2）5μl、dNTP混和物2μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl、引物ET1 2μl、引物ET2 4μl、引物ET3 2μl，灭菌超纯水29.7μl）］，共50μl反应体系。检测参考品同法操作。每个供试品平行做2管。 反应体系于94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、64℃退火1分钟、72℃延伸30秒，循环30次后，72℃再延伸7分钟。取PCR产物10μl加6倍加样缓冲液［配方为：①吸取2ml EDTA（500mmol/L pH8.0）加入约40ml双蒸水；②称量250mg溴酚蓝；③量取加入50ml丙三醇；④定容至100ml，4℃保存］2μl混匀后上样于3%的琼脂糖凝胶泳道，50bp DNA ladder直接上样6μl。于100mA电泳50分钟。以50bp DNA ladder为分子量标记，观察供试品与参考品PCR扩增片段分子量大小。 2.1.4.2 纯菌检查 按通则1101的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。 2.1.4.3 毒力试验 用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，观察5周动物体重不应减轻；同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。 2.1.4.4 无有毒分枝杆菌试验 用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300～400g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只豚鼠，满3个月时解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量0.85%～0.90%氯化钠溶液混匀后，由皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上时应复试。 2.1.5 种子批的保存 种子批应冻干保存于8℃以下。 2.2 原液 2.2.1 生产用种子 启开工作种子批菌种，在L-J培养基、苏通马铃薯培养基、液体苏通培养基上每传1次为1代。在马铃薯培养基培养的菌种置冰箱2～8℃保存，不得超过2个月。 2.2.2 生产用培养基 工作种子批首次复苏可用L-J培养基，生产用培养基为苏通马铃薯培养基、液体苏通培养基或批准的其他培养基。 2.2.3 接种与培养 挑取生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基的表面，置37～39℃静止培养。 2.2.4 收获和合并 培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜压干，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原稳定剂稀释，制成原液。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制 用稳定剂将原液浓度调整至适宜浓度，即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装与冻干 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。分装过程中应使半成品混合均匀，分装后应立即冻干，冻干后应立即封口。 2.4.3 规格 每瓶含卡介菌60mg，每1mg卡介菌含活菌数应不低于1.0×106cfu。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3. 检定 3.1 原液检定 3.1.1 纯菌检查 按通则1101的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。 3.1.2 浓度测定 用以分光光度法测定浓度，应为标示量的±20%。 3.2 半成品检定 3.2.1 纯菌检查 按通则1101的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。 3.2.2 浓度测定 以分光光度法测定浓度，应为标示量的±20%。 3.3 成品检定 除装量差异、水分测定、活菌数测定、热稳定性试验、毒性试验、无有毒分枝杆菌试验和抑瘤试验外，按每瓶加入1ml注射用水，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 3.3.1.1 抗酸染色法 抗酸染色涂片检查，细菌形态与特性应符合卡介菌特征。 3.3.1.2 多重PCR法 按2.1.4.1项进行，釆用多重PCR法检测卡介菌基因组特异的缺失区RD1，应无RD1序列存在，供试品扩增产物大小应与检测参考品一致。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为白色或淡黄色疏松体或粉末状，按标示量加入注射用水，应在3分钟内复溶呈均匀悬液。 3.3.2.2 装量差异 依法检查（通则0102），应符合规定。 3.3.3 水分 应不高于3.0%（通则0832）。 3.3.4 纯菌检查 按3.1.1项进行。 3.3.5 活菌数测定 每亚批疫苗均应做活菌数测定。活菌数应不低于1.0×106CFU/mg。本试验可与热稳定性试验同时进行。 3.3.6 热稳定性试验 取每亚批疫苗于37℃放置28天测定活菌数，并与2～8℃保存的同批疫苗进行比较，计算活菌率；放置37℃的本品活菌数应不低于置2～8℃本品的25%，且不低于2.5×105cfu/mg。 3.3.7 毒性试验 用18～20g昆明小白鼠5只，每只腹腔注射0.5ml菌液（30mg），观察1周，到期称总体重，不得较试验前减轻或死亡。 3.3.8 无有毒分枝杆菌试验 用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300～400g的同性健康豚鼠6只，每只皮下注射1ml供试品（10mg/ml），注射前称体重，每2周称体重一次，观察6周，动物体重不应减轻；同时解剖检查每只动物，若肝、脾、肺等脏器无结核病变，即为合格。若动物死亡或有可疑病灶时，应按2.1.4.3项进行。 3.3.9 抑瘤试验（H22实体瘤） 以H22肿瘤细胞悬液和供试品悬液同体积混合配制试验组用样品，皮下移植到雌性BALB/c小鼠（6～8周）体内，对照组仅移植H22肿瘤细胞悬液。移植3周后测 定实体肿瘤的重量，计算肿瘤生长抑制率（%）［（对照组实体肿瘤的重量－试验组实体肿瘤的重量）/对照组实体肿瘤的重量×100］。肿瘤生长抑制率应不低于75%，并且试验组与对照组的肿瘤重量差异有显著意义。 3.3.10 浓度测定 用分光光度法测定浓度，应为标示量的±20%。 4. 稀释剂 稀释剂为0.85%～0.90%氯化钠溶液。应符合本版药典（二部）的相关规定。 5. 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 6. 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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