本品系由高效表达人表皮生长因子基因的毕赤酵母，经发酵、分离和高度纯化后获得的人表皮生长因子，加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂、抑菌剂，不含抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人表皮生长因子工程菌株系由带有人工合成人表皮生长因子基因的重组质粒转化的毕赤酵母菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种BMG1琼脂平板 应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 应为典型的酵母菌形态，应形状规则，用亚甲蓝染色，无死亡细胞。 2.1.3.3 筛选标志检查 应符合该基因表型特征。 2.1.3.4 人表皮生长因子表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.5 人表皮生长因子基因稳定性检查 涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95%。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养。 2.2.2 发酵用培养基 釆用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理上清液。 2.2.5 纯化 采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为人表皮生长因子原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.6 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 采用的基质应符合凝胶剂基质要求（通则0114）。 2.3.1 配制 按经批准的配方进行配制。 2.3.2 凝胶制备 按经批准的工艺进行。凝胶应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。 2.3.3 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 21000IU（5g）/支勘误5 万IU (100μg) /10g /支；10 万IU (200μg) /20g/支。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（通则3528）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每lmg蛋白质应不低于5.0×105IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为17.5%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A（三氟乙酸-水溶液：量取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B（三氟乙酸-乙腈溶液：量取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22%～37%流动相B）。上样量应不低于5μg，在波长280nm处检测。以人表皮生长因子色谱峰计算的理论板数应不低于500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg。供试品的分子质量应为5.9kD±0.6kD。 3.1.6 外源性DNA残留量 每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。 3.1.7 宿主菌蛋白质残留量 应不高于蛋白质总量的0.1%（通则3414）。 3.1.8 甲醇含量 应不高于0.002%（通则0521）。 3.1.9 等电点 主区带应为4.0～5.0，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。 3.1.8 紫外光谱 用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路lcm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。 3.1.9 肽图 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.10 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为： Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。 3.1.11 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.2 半成品检定 3.2.1 生物学活性 应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（通则3528），应符合要求。 3.2.2 无菌检查 应按经批准的方法预处理供试品，依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为无色透明凝胶，无颗粒，不析水。 3.3.2.2 装量 依法检查（通则0118），应符合规定。 3.3.3 化学检定 pH值 应为6.5～8.0（通则0631）。 3.3.4 生物学活性 应为标示量的70%～200%（通则3528）。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于4～25℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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