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核酸序列检查法

    药品名称: 3304 SV40核酸序列检查法
    版本: 2020年版
    来源: 四部
    分类: 通则
    内容:

    本法系通过设计2对特异引物扩增SV40 VP1 100bp(2220~2319)和大T抗原C端451bp(2619~3070)2个片段,采用PCR检查供试品中是否存在SV40核酸序列。

    供试品溶液及对照溶液的制备 取供试品400μl,加2%蛋白酶K溶液25μl、10%SDS溶液50μl、0.05mol/L本EDTA溶液(pH8.0)10μl,置56℃培养1小时,用等体积的酚-三氯甲烷(1:1)混合液抽提后,再用等体积的三氯甲烷抽提,加2倍体积的乙醇,﹣20℃放置16小时,以每分钟10000转离心15分钟,沉淀用75%乙醇溶液洗涤干燥,加无DNA酶和RNA酶的水10μl,使溶解。阳性对照及阴性对照按上述方法与供试品同时处理。

    引物

    VP1上游引物:2220 5'-ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3' 2240

    VP1下游引物:2319 5'-GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3' 2297

    T抗原C端上游引物:3070 5'-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3' 3049

    T抗原C端下游引物:2619 5'-GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3' 2641

    检查法 (1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12mol,DNA模板加量为1μl,总体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟,然后94℃变性20秒、50℃退火20秒、72℃延伸40秒,共进行40个循环;72℃延伸3分钟。

    (2)扩增产物电泳检查 2%琼脂糖凝胶(每1ml含1μg溴化乙锭),缓冲液为1×TAE,在100V条件下电泳40分钟,检查扩增片段。VP1扩增片段为100bp,大T抗原C端片段为451bp。

    (3)以同样模板重复扩增VP1片段,排除污染因素导致的非特异扩增;或将扩增产物及对照从胶上移至Hybond N尼龙膜上,与VP1探针进行免疫印迹试验,以证明所扩增片段确为VP1片段。

    (4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C端扩增产物进行序列测定。

    结果判定 阳性对照应得到特异产物,阴性对照应无相应片段,则试验成立。

    若未能扩增出VP1片段,则结果判定为未检出SV40核酸序列。

    若扩增出VP1片段,可重复试验1次,未扩增出VP1片段者,判定为未检出SV40核酸序列。若重试仍能扩增出VP1片段,则应扩增大T抗原C端片段,如扩增出大T抗原C端片段,应将其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较,核酸序列一致者,判定为检出SV40核酸序列;如未扩增出大T抗原C端片段,则可按上述“检查法”步骤(1)~(3)重复试验1次,如仍未扩增出大T抗原C端片段,则可判定为未检出SV40核酸序列。

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