本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎（简称乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入铝佐剂制成。用于预防乙型肝炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 生产用菌种 2.1.1 名称及来源 以DNA重组技术构建的表达HBsAg并经批准的重组酿酒酵母工程菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 主种子批和工作种子批的代次应符合批准的要求。 2.1.3 种子批菌种的检定 主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。 2.1.3.1 培养物纯度 培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板，或其他适宜的培养基，分别于20℃~25℃和30℃~35℃培养5~7天，应无细菌和其他真菌被检出。 2.1.3.2 HBsAg基因序列测定 HBsAg基因序列应与原始菌种保持一致。 2.1.3.3 质粒保有率 采用平板复制法检测。将菌种接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应符合批准的要求。 2.1.3.4 活菌率 采用血细胞计数板，分别计算每1ml培养物中总菌数和活菌数，活菌率应不低于50%。 2.1.3.5 抗原表达率 取种子批菌种扩增培养，采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，测定破碎液的蛋白质含量（通则0731第二法），并采用酶联免疫吸附法（通则3429）或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5%。 2.1.4 菌种保存 种子批保存应符合批准的要求。 2.2 原液 2.2.1 发酵 取工作种子批菌种，按批准的工艺培养发酵，收获的酵母菌应冷冻保存。 2.2.2 培养物检定 2.2.2.1 培养物纯度 按2.1.3.1项进行。 2.2.2.2 质粒保有率 按2.1.3.3项进行，应符合批准的要求。 2.2.3 培养物保存 于-60℃以下保存不超过6个月。 2.2.4 纯化 培养物经细胞破碎去除细胞碎片，采用硅胶吸附、疏水色谱法、硫氰酸盐处理等步骤或经批准的方法提取、纯化，即为HBsAg纯化产物。取纯化产物按批准的工艺制备原液。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.2.6 原液保存 于2~8℃保存，保存时间应符合批准的要求。 2.3 半成品 2.3.1 甲醛处理 如原液采用甲醛处理，甲醛溶液浓度、处理温度及时间等应符合批准的要求。 2.3.2 铝吸附 将抗原与铝佐剂按经批准的工艺进行吸附。用0.85%~0.90%氯化钠溶液洗涤，去上清液后再恢复至原体积，即为铝吸附产物。 2.3.3 配制 按批准的工艺，将吸附的抗原采用适宜的溶液稀释至规定的蛋白质浓度，即为半成品。 2.3.4 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 每瓶/支0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含HBsAg 10μg；或每1次人用剂量1.0ml，含HBsAg 20μg或60μg。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法），应符合批准的要求。 3.1.3 分子量 采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（通则0541第五法），分离胶胶浓度15%，上样量为0.5μg，银染法染色。主要蛋白质条带的分子质量应为20~25kD；可有多聚体蛋白质带。 3.1.4 N端氨基酸序列测定（每年至少测定1次） 取纯化产物或原液用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定，N端氨基酸序列应为： Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。 3.1.5 纯度 采用免疫印迹法测定（通则3401），所测供试品中酵母杂蛋白应符合批准的要求；采用高效液相色谱法（通则0512），亲水硅胶高效体积排阻色谱柱；排阻极限1000kD；孔径45nm，粒度13μm，流动相为含0.05%叠氮钠和0.1%SDS的磷酸盐缓冲液（pH7.0）；上样量100μl；检测波长280nm。按面积归一法计算P60蛋白质含量，杂蛋白应不高于1.0%。 3.1.6 细菌内毒素检查 应小于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。 3.1.7 宿主细胞DNA残留量 取纯化产物或原液测定，应不高于10ng/剂（通则3407）。 3.2 半成品检定 3.2.1 吸附完全性 将供试品于6500g离心5分钟取上清液，依法测定（通则3501）参考品、供试品及其上清液中HBsAg含量。以参考品HBsAg含量的对数对其相应吸光度对数作直线回归，相关系数应不低于0.99，将供试品及其上清液的吸光度值代入直线回归方程，计算其HBsAg含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。 式中 P为吸附率，%; cs为供试品上清液的HBsAg含量，μg/ml； ct为供试品的HBsAg含量，μg/ml。 3.2.2 化学检定 3.2.2.1 硫氰酸盐残留 如生产中使用，应按下列方法检测，残留量应符合规定。 将供试品于6500g离心5分钟，取上清液。分别取含量为1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml的硫氰酸盐标准溶液，供试品上清液，0.85%~0.90%氯化钠溶液各5.0ml于试管中，每一供试品取2份，在每管中依次加入硼酸盐缓冲液（pH9.2）0.5ml，2.25%氯胺T-生理氯化钠溶液0.5ml，50%吡啶溶液（用0.85~0.90%氯化钠溶液配制）1.0ml，每加一种溶液后立即混匀，加完上述溶液后静置10分钟，以0.85%~0.90%氯化钠溶液为空白对照，在波长415nm处测定各管吸光度。以标准溶液中硫氰酸盐的含量对其吸光度均值作直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程，计算硫氰酸盐含量，应小于1.0μg/ml。 3.2.2.2 Triton X-100残留 如生产中使用，应按下列方法检测，残留量应符合规定。 将供试品于6500g离心5分钟，取上清液。分别取含量为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的Triton X-100标准溶液，供试品上清液，0.85%~0.90%氯化钠溶液各2.0ml于试管中，每一供试品取2份，每管分别加入5%（ml/ml）苯酚溶液1.0ml，迅速振荡，室温放置15分钟。以0.85%~0.90%氯化钠溶液为空白对照，在波长340nm处测定各管吸光度。以标准溶液中Triton X-100的含量对其吸光度均值作直线回归，计算相关系数，应不低于0.99，将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程，计算Triton X-100含量，应小于15.0μg/ml。 3.2.2.3 pH值 应为5.5~7.2（通则0631）。 3.2.2.4 游离甲醛含量 如生产中使用，应不高于20μg/ml（通则3207第二法）。 3.2.2.5 铝含量 应符合批准的要求且铝含量不高于0.62mg/ml（通则3106）。 3.2.2.6 渗透压摩尔浓度 应为280mOsmol/kg±65mOsmol/kg（通则0632）。 3.2.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.4 细菌内毒素检查 应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 采用酶联免疫吸附法（通则3429）检查，应证明含有HBsAg。 3.3.2 外观 应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。 3.3.3 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.3.4 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.5 化学检定 3.3.5.1 pH值 应为5.5~7.2（通则0631）。 3.3.5.2 铝含量 应为0.35~0.62mg/ml（通则3106）。 3.3.6 体外相对效力测定 应不低于0.5（通则3501）。 3.3.7 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.8 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 3.3.9 细菌内毒素检查 应小于5EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期按批准的执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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