本品系用结核分枝杆菌经培养、杀菌、过滤除去菌体后纯化制成的纯蛋白衍生物，用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后机体免疫反应的监测。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 结核菌素纯蛋白衍生物（TE-PPD）生产车间必须符合国家生物安全防护等级的要求，必须与其他生物制品生产车间及实验室分开。原液生产全部过程，包括结核分枝杆菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行，所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。从事TE-PPD生产的工作人员必须身体健康，经X射线检查无结核病，且每年经X射线检查1～2次，可疑者应暂离该制品的制造。 2 制造 2.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.1 名称及来源 采用人型结核分枝杆菌CMCC 93009（H37Rv）菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.3 种子批的传代 自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。 2.1.4 种子批的检定 2.1.4.1 染色镜检 应为短粗杆菌，微弯曲两端圆，抗酸染色阳性。 2.1.4.2 生化反应 硝酸盐还原反应、尿素酶反应应为阳性，耐热触酶、聚山梨酯80水解应为阴性（通则3605）。 2.1.5 种子批的保存 冻干菌种保存于8℃以下，液体菌种保存于-70℃以下。 2.2 原液 2.2.1 生产用种子 取工作种子批菌种于L-J培养基、苏通马铃薯培养基或改良苏通综合培养基或其他适宜培养基中传代培养，作为生产用种子。 2.2.2 培养基 工作种子批菌种首次复苏可用L-J培养基，生产用培养基采用苏通马铃薯培养基、改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基。 2.2.3 接种和培养 启开菌种后接种于苏通马铃薯培养基，置37℃培养2～3周，可在苏通马铃薯培养基上再传1代或直接挑取生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，于37℃静置培养1～2周，挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他培养基的表面，于37℃静置培养8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，应废弃。 2.2.4 收获及杀菌 培养终止，将培养物于121℃、30分钟杀菌后，过滤除去菌膜及菌体。如滤液需保存，应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的抑菌剂，于2～8℃保存，保存期不超过30天。 2.2.5 纯化 收集滤液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，或采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。 2.2.6 合并与分装及冻干 2.2.6.1 合并 同批分次纯化的原液可以合并，但不得超过5次。 2.2.6.2 分装及冻干 原液检定合格后，可根据蛋白质含量将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即冻干。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.2.8 保存及有效期 原液应于2～8℃保存。液体原液自效价测定合格之日起，有效期为5年；原液冻干品自效价测定合格之日起，每隔5年应按3.1项进行检定，合格后可继续使用。 2.3 半成品 2.3.1 配制 经检定合格的原液，用0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀释至20IU/ml或50lU/ml。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量为0.1ml，含TB-PPD 5IU、2IU。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 外观 原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。 3.1.2 复溶时间 冻干品按标示量加入注射用水后，应于3分钟内完全溶解。 3.1.3 水分 冻干品水分应不高于3.0%（通则0832）。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.4.2 多糖与核酸含量 每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。 （1）多糖含量测定 以0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100 μg/ml葡萄糖标准品溶液。将硫酸225ml加入75ml0.85%～0.90%氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准品溶液以及本品，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，置沸水浴20分钟后在波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准品溶液浓度对应其吸光度，用Minitab或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。 3.1.5 效价测定 3.1.5.1 动物法 将标准品及本品分别稀释3个不同稀释度，至少取4只已经结核分枝杆菌致敏的体重为400～600g的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度本品各0.1ml或0.2ml，于注射后24小时、48小时观察局部硬结的纵径与横径（可根据48小时的反应结果判定）。计算每个稀释度注射后2天的硬结反应总和或平均面积，并求其比值，每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为0.8～1.2。如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求。 3.1.5.2 稀释度选择 稀释度的选择应能使本品注射后24小时所产生的局部硬结反应直径为8～25mm；本品和标准品的硬结反应直径大小应相似，且本品和标准品的3个稀释度的剂量对数反应曲线应基本平行。如本品效价与标准品效价不一致，可用同样方法复试1次，并算出相当于标准品的效价，进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至符合要求。 3.1.6 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.7 无分枝杆菌试验 量取1.0ml本品，分别接种于10支罗氏鸡蛋培养基，于37℃培养4周，应无分枝杆菌生长。 3.1.8 致敏效应试验 试验组与对照组分别选用体重300～400g未做过任何试验的豚鼠各3只，试验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含500IU本品，共3次，每次间隔5天。在第3次注射后15天，试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.1ml含500IU本品，连续观察3天，两组动物反应无明显区别。 3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 取经结核分枝杆菌致敏的豚鼠至少4只，皮内注射0.2ml本品，24小时后豚鼠的平均硬结反应直径（纵、横直径相加除以2）均应不小于5mm。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为无色澄明液体，无不溶物或异物。 3.3.2.2 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 pH值 应为6.8～7.4（通则0631）。 3.3.3.2 苯酚含量 应不高于3.0g/L（通则3113）。 3.3.4 效价测定 取经致敏的体重为400～600g豚鼠，皮内注射0.2ml标准品与本品，至少各4只，注射后24小时、48小时各观察结果1次（可根据48小时的反应结果判定），计算本品和TB-PPD标准品的平均硬结反应直径，计算累计值，并求其比值，应为0.8～1.2。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.6 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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