本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。 测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。 除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。 第一法 管碟法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 菌悬液的制备 枯草芽泡杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽抱杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。 短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽砲杆菌〔CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。 金黄色葡萄球菌（Szaphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液 取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌〔ATCC 9763〕的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于IV号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）悬液 取肺炎克雷伯菌〔CMCC（B）46 117〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。 支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）悬液 取支气管炎博德特菌〔CMCC（B）58 403〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。 标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。 供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。 双碟的制备 取直径约90mm，高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（表1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量(能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm)，摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管(内径为6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为7.8mm±0.1mm)4个(二剂量法)或6个(三剂量法)，用陶瓦圆盖覆盖备用。 检定法 二剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2∶1或4∶1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径(或面积)，照生物检定统计法(通则1431)中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。 三剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度(S3)、中浓度(S2)及低浓度(S1)的标准品溶液，其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径(或面积)，照生物检定统计法(通则1431)中的(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。 注：①两性霉素B双碟的制备，用菌层15ml代替两层。 ② 乙酰螺旋霉素，抗II检定培养基制备时，调节pH值使灭菌后为8.0～8.2。 ③ 含3%氯化钠。 ④ 加0.3%葡萄糖。 第二法 浊度法 本法系利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。 菌悬液制备 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26 003〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 大肠埃希菌(Escherichia coli)悬液 取大肠埃希菌〔CMCC(B)44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 白色念珠菌(Candida albicans)悬液 取白色念珠菌〔CMCC(F)98 001〕的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于10ml培养基Ⅸ中，置35～37℃培养8小时，再用培养基IX稀释至适宜浓度，备用。 标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表3的规定进行稀释。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。 供试品溶液的制备 精密称(或量)取供试品适量，照各品种项下规定进行供试品溶液的配制。 含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（35～37℃培养3～4小时后测定的吸光度在0.3～0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量-反应关系和适宜的测定浊度。 已接种试验菌的液体培养基应立即使用。 检定法 标准曲线法 除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各品种项下规定的剂量-反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度，标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1∶1.25或更小），供试品根据估计效价或标示量溶液选择中间剂量，每一剂量不少于3个试管。在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时），在线测定或取出立即加入甲醛溶液（1→3）0.5ml以终止微生物生长，在530nm或580nm波长处测定各管的吸光度。同时另取2支试管各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml，其中一支试管与上述各管同法操作作为细菌生长情况的阳性对照，另一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为吸光度测定的空白液。照标准曲线法进行可靠性检验和效价计算。 抗生素微生物检定法标准曲线法的计算及统计学检验 标准曲线法的计算及可靠性检验 1.标准曲线的计算 将标准品的各浓度lg值及相对应的吸光度列成表4。 按公式（1）和（2）分别计算标准曲线的直线回归系数（即斜率）b和截距a从而得到相应标准曲线的直线回归方程(3): 直线回归方程：Y=bX+a（3） 2.回归系数的显著性测验 判断回归得到的方程是否成立，即X、Y是否存在着回归关系，可采用t检验。 假设H0：b=0，在假设H0成立的条件下，按公式（4）～（6）计算t值。 估计标准差： 回归系数标准误： 式中 yi为标准品的实际吸光度； Y为估计吸光度〔由标准曲线的直线回归方程（3）计算得到〕； ?y为标准品实际吸光度的均值； xi为抗生素标准品实际浓度lg值; ?x为抗生素标准品实际浓度lg值的均值。 对于相应自由度（2n-4）给定的显著性水平a（通常a =0.05），查表得ta∕2(n-2)，若|t|＞ta∕2(n-2)，则拒绝H0，认为回归效果显著，即Χ、Y具有直线回归关系；若|t|≤ta∕2(n-2)，则接受H0，认为回归效果不显著，即Χ、Y不具有直线回归关系。 3.测定结果的计算及可信限率估计 3.1 抗生素浓度lg值的计算 当回归系数具有显著意义时，测得供试品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程（3），按方程（7）计算抗生素的浓度lg值。 抗生素的浓度lg值： 3.2 抗生素浓度（或数学转换值）可信限的计算 按公式（4）和（8）计算得到的抗生素浓度lg值在95%置信水平（a=0.05）的可信限。 X0的可信限： 式中 n为标准品的浓度数乘以平行测定数； m为供试品的平行测定数； X0为根据线性方程计算得到的抗生素的浓度lg值； Y0为抗生素供试品吸光度的均值。 3.3 可信限率的计算 按公式（9）计算得到的抗生素浓度（或数学转换值）的可信限率。 式中X0应以浓度为单位。 其可信限率除另有规定外，应不大于5%。 3.4 供试品含量的计算 将计算得到的抗生素浓度（将lg值转换为浓度）再乘以供试品的稀释度，即得供试品中抗生素的量。 二剂量法或三剂量法 除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，选择适宜的高、（中、）低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，二剂量的剂距为2∶1或4∶1，三剂量的剂距为1∶0.8。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法和（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。 培养基及其制备方法 培养基Ⅰ 胨 5g 琼脂 15～20g 牛肉浸出粉 3g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3g 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅱ 胨 6g 葡萄糖 1g 牛肉浸出粉 1.5g 琼脂 15～20g 酵母浸出粉 6g 水 1000ml 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅲ 胨 5g 磷酸氢二钾 3.68g 牛肉浸出粉 1.5g 磷酸二氢钾 1.32g 酵母浸出粉 3g 葡萄糖 1g 氯化钠 3.5g 水 1000ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅳ 胨 10g 葡萄糖 10g 氯化钠 10g 琼脂 10g 枸椽酸钠 10g 水 1000ml 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。 培养基V 胨 10g 琼脂 20～30g 麦芽糖 40g 水 1000ml 除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅵ 胨 8g 酵母浸出粉 5g 牛肉浸出粉 3g 磷酸二氢钾 1g 氯化钠 45g 琼脂 15～20g 磷酸氢二钾 3.3g 水 1000ml 葡萄糖 2.5g 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅶ 胨 5g 枸椽酸钠 10g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g 磷酸氢二钾 7g 水 1000ml 磷酸二氢钾 3g 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基Ⅷ 酵母浸出粉 1g 琼脂 15～20g 硫酸铵 1g 磷酸盐缓冲液 葡萄糖 5g (pH6.0) 1000ml 混合上述成分，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。 培养基IX 蛋白胨 7.5g 氯化钠 5.0g 酵母膏 2.0g 葡萄糖 10.0g 牛肉浸出粉 1.0g 水 1000ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.5，在115℃灭菌30分钟。 营养肉汤培养基 胨 10g 肉浸液? 1000ml 氯化钠 5g 取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，在115℃灭菌30分钟。 营养琼脂培养基 胨 10g 琼脂 15～20g 氯化钠 5g 肉浸液? 1000ml 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 改良马丁培养基 胨 5.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 琼脂 15～20g 磷酸氢二钾 l.0g 水 1000ml 葡萄糖 20.0g 除葡萄糖外，混合上述成分，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。 多黏菌素B用培养基 蛋白胨 6.0g 酵母浸膏 3.0g 牛肉浸膏 1.5g 琼脂 15～20g 胰消化酪素 4.0g 水 1000ml 葡萄糖 1.0g 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.7，在115℃灭菌30分钟。 培养基可以釆用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。 灭菌缓冲液 磷酸盐缓冲液(pH5.6) 取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pH6.0) 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pH7.8) 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 磷酸盐缓冲液(pHl0.5) 取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钠溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。 ? 肉浸液也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代替。 |
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