1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的大肠埃希菌或腐生型假单胞菌菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种LB琼脂平板 应呈典型大肠埃希菌集落形态，无其他杂菌生长。勘误应呈典型大肠埃希菌或腐生型假单胞菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 采用大肠埃希菌为载体的，其菌株应为典型的革兰氏阴性杆菌；釆用腐生型假单胞菌为载体的，其菌株应呈棒状，可运动，有荚膜，无芽砲，涂片染色后应呈典型的革兰氏阴性。 2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。 2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 采用大肠埃希菌为载体的，其菌种应为典型大肠埃希菌形态；采用腐生型假单胞菌为载体的，其菌种应为腐生型假单胞菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5 生化反应 采用大肠埃希菌为载体的，其菌种应符合大肠埃希菌生化反应特性；采用腐生型假单胞菌为载体的，其菌种的生化反应须不液化明胶，不水解淀粉和聚庞羟基丁酸酯（通则3605），不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。 2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7 表达的干扰素型别 应用抗α2b型干扰素血清做中和试验，证明型别无误。 2.1.3.8 质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。 2.1.3.9 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存，保存时间应不超过1年。 2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人干扰素α2b原液。如需存放，应规定时间和温度。勘误经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，根据产品具体情况，可加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人干扰素α2b原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8笆。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 2.4.3规格 300万IU/瓶；500万IU/瓶 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（通则3523）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测，以干扰素色谱峰计算的理论板数应不低于1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 相关蛋白 依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：C18柱，4.6mmX25cm，粒径5μm或其他适宜的色谱柱），柱温为室温；以0.2%三氟乙酸-30%乙腈的水溶液为流动相A，以0.2%三氟乙酸-80%乙腈的水溶液为流动相B；流速为1.0ml/min；在波长210nm处检测；按下表进行梯度洗脱。 对照品溶液及供试品溶液图谱中，干扰素主峰的保留时间约为20分钟。对照品溶液图谱中，氧化型峰相对于主峰的保留时间约为0.9，氧化型峰与主峰的分离度应不小于1.0。 按面积归一化法只计算相对于主峰保留时间为0.7～1.4的相关蛋白峰面积，单个相关蛋白峰面积应不大于总面积的3.0%，所有相关蛋白峰面积应不大于总面积的5.0%。 3.1.6 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0昭，制品的分子质量应为19.2kD±1.9kD。 3.1.7 外源性DNA残留量 每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。 3.1.8 鼠IgG残留量 如采用单克隆抗体亲和色谱法纯化，应进行本项检定。每1次人用剂量鼠IgG残留量应不高于l00ng（通则3416）。 3.1.9 宿主菌蛋白质残留量 采用大肠埃希菌表达的制品应不高于蛋白质总量的0.10%（通则3412）。釆用腐生型假单胞菌表达的制品应不高于蛋白质总量的0.02%（通则3413）。 3.1.10 残余抗生素活性 依法测定（通则3408），不应有残余氨華西林或其他抗生素活性。 3.1.11 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。 3.1.12 等电点 釆用大肠埃希菌表达的制品主区带应为4.0～6.7，采用腐生型假单胞菌表达的制品主区带应为5.7～6.7。供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。 3.1.13 紫外光谱 用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路lcm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为278nm±3nm（通则0401）。 3.1.14 肽图 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.15 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为： （Met）-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。 3.2 半成品检定 3.2.1 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。 3.2.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为澄明液体。 3.3.2.2 可见异物 依法检查（通则0904），应符合规定。 3.3.2.3 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1pH值 应为6.5～7.5或应符合批准的要求（通则0631）。 3.3.3.2 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.4 生物学活性 应为标示量的80%～150%（通则3523）。 3.3.5 残余抗生素活性 依法测定 （通则3408），不应有残余氨苯西林或其他抗生素活性。 3.3.6 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.7 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。 3.3.8 异常毒性检查 依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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