本法系采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳(icIEF)，依据不同电荷变异体的等电点(pI)特征，按毛细管 电泳法(通则0542)将其分离，测定单抗产品各电荷变异体的等电点并计算相对百分含量。 全柱成像毛细管等电聚焦电泳系统 (1)检测器 紫外检测器，波长为280nm。 (2)毛细管 涂层石英毛细管。 试剂 (1)水(电阻率不低于18.2MΩ?cm)。 (2)甲基纤维素溶液 称取甲基纤维素10g，加水溶解并稀释至1000ml，配制成1%甲基纤维素溶液，0.22μm滤膜过滤，2～8℃保存。取该溶液与超纯水以1:9稀释，配制成0.1%甲基纤维素溶液，2～8℃保存。 (3)两性电解质(pH3～10)。 (4)80mmol/L磷酸的0.1%甲基纤维素溶液。 (5)100mmol/L氢氧化钠的0.1%甲基纤维素溶液。 (6)等电点标志物(pl Marker) 所选用等电点标志物的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。 系统适用性对照品溶液的制备 采用适宜浓度的单克隆抗体作为系统适用性对照品。系统适用性对照品应经国家药品检定机构审查、认可。 (1)用水将系统适用性对照品稀释至lmg/ml。 (2)进样预混溶液制备(可根据比例一次性配制多个供试品使用的预混溶液)。 (3)取系统适用性对照品预稀释溶液(lmg/ml)40μl，加入预混溶液160μl，混匀，以每分钟13000转离心5分钟。取150μl上清液，转移至进样瓶，低电压(1000V或1500V)预聚焦1分钟后，高电压(3000V)聚焦7.5分钟。 对照品溶液的制备 对照品系经证明足够稳定可用于鉴别、理化分析的代表批次的产品，参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。可根据产品特征调整对照品预混溶液体系组分或比例、终浓度等。 供试品溶液的制备 参照对照品溶液进行制备。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制，但不含有单抗的溶液。若研究表明制剂配方成分与纯水的图谱无显著差异，也可用纯水制备空白对照。空白对照溶液参照对照品溶液进行制备。 测定法 取对照品/供试品溶液，按所选设备进样时间等参数自动进样，低电压（1000V或1500V）预聚焦1分钟后，高电压（3000V）聚焦4.5～15分钟，样品室温度为4～10℃，毛细管温度（环境温度）为18～25℃。可根据产品特征调整聚焦电压、聚焦时间、样品室温度等。 进样顺序：系统适用性对照品溶液至少进样2针、空白对照溶液进样1针、对照品溶液进样1针，供试品溶液1、供试品溶液2……系统适用性对照品至少进样1针。 系统适用性系统适用性 对照品进样应不少于3针（序列起始至少2针，序列尾至少1针）且主峰pI标准偏差、主峰相对百分含量、主峰相对百分含量的标准偏差及相对标准偏差应在规定范围内（见该批次系统适用性对照品的说明书）。系统适用性对照品电泳图谱应与参考图谱相似。 空白对照图谱中两个等电点标志物均被检出，且等电点标准物峰之间的供试品积分区域应无干扰积分的倒峰、尖峰等非蛋白峰。 结果计算 以各等电点标志物的等电点（pI）对其相应的像素值作线性回归，将电荷变异体的像素值代入线性回归方程，求出电荷变异体的等电点。按峰面积归一化法计算，各电荷变异体的峰面积占所有峰面积之和的百分比即为该电荷变异体的相对百分含量。 注意事项 （1）如供试品的盐浓度较高，需对其进行脱盐前处理。 （2）由于icIEF分析仪器品牌不同、毛细管品牌或者规格存在差异，系统适用性对照品电泳图谱与参考图谱峰型相比，可略有差异。 |
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