本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定维生素D（包括维生素D2和维生素D3，下同）及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D 0.025μg。 测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素A醇和其他成分干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定；存在维生素A醇和其他成分干扰的供试品也可按第四法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据供试品中所含维生素D的成分，取相应的维生素D2或D3对照品约25mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，超声处理1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（1）;精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2）。 测定维生素D2时，应另取维生素D3对照品25mg，同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂；以正己烷-正戊醇（997:3）为流动相；检测波长为254nm。量取维生素D3对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出，迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°并距灯管5～6cm，照射5分钟，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；量取该溶液注入液相色谱仪，进样5次，记录峰面积，维生素D3峰的相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.5）与反式维生素D3峰（与维生素D3相对保留时间约为0.6）以及维生素D3峰与速甾醇D3峰（与维生素D3相对保留时间约为1.1）的分离度均应大于1.00。 校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液（1）或贮备溶液（2）5ml，置50ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f1对照品溶液；取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算维生素D的校正因子f1。 f1 =c1/A1 式中 c1为维生素D对照品溶液的浓度，μg/ml; A1为对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积。 另精密量取对照品贮备溶液（1）或贮备溶液（2）5ml，置50ml量瓶中，加2，6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为校正因子f2混合对照品溶液；取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算前维生素D的校正因子f2。 f2=(c1-f1A1)/A2 式中 c1为f1测定项下维生素D对照品溶液的浓度，μg/ml； f1为维生素D的校正因子； A1为混合对照品溶液色谱图中维生素D峰的峰面积； A2为混合对照品溶液色谱图中前维生素D峰的峰面积。 测定法 取该品种项下制备的供试品溶液测定，按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量（ci）。 ci=f1Ai1+f2Ai2 式中 Ai1为维生素D峰的峰面积； Ai2为前维生素D峰的峰面积。 第二法 校正因子测定 取第一法的对照品贮备溶液（2），照第一法校正因子测定项下所述操作，即得维生素D的校正因子f1和前维生素D的校正因子f2，进样量为100～200μl。 供试品溶液A的制备 取供试品适量（相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g），精密称定，置皂化瓶中，加乙醇30ml、维生素C 0.2g与50%氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g，则加50%氢氧化钾溶液4ml]，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml，以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。 净化用色谱系统分离收集维生素D 精密量取上述供试品溶液A500μl，注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙腈-水（50:50:2）为流动相进行分离，检测波长254nm，记录色谱图，维生素D与前维生素D应为重叠峰，并能与维生素A及其他杂质分开。准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入正己烷溶液适量，使每1ml中含维生素D 50～140单位，密塞，超声处理使溶解，即得供试品溶液B。 测定法 取供试品溶液B，照第一法进行含量测定，进样量为100～200μl。 第三法 供试品溶液的制备 取该品种项下制备的供试品溶液A，按上述第二法净化用色谱系统分离收集维生素D项下的方法处理，至“用氮气流迅速吹干”后，加入异辛烷2ml溶解，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即得供试品溶液C。 对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液（1）适量，加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位，精密量取2ml，置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法，自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。 测定法 照第一法项下的色谱条件，精密量取对照品溶液与供试品溶液C各200μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算维生素D的含量。 第四法 校正因子测定 取第一法的对照品贮备溶液（1）制成的校正因子f1对照品溶液和校正因子f2混合对照品溶液各2ml，分别置100ml量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，制成校正因子f1对照品溶液（1）和校正因子f2混合对照品溶液（1），取100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按第一法项下的方法计算，即得校正因子f1和校正因子f2。 供试品溶液制备 取供试品适量（相当于维生素D总量500单位），精密称定，置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 色谱条件与系统适用性实验 检测波长265nm，柱温40℃，流速为每分钟0.5ml。收集管为聚醚醚酮（peek）管，内径0.0762cm（0.03英寸），20m，容积约9ml。 第一维液相色谱：以脲基键合硅胶为填充剂（Ureagroup，2.1mm×150mm，3μm，或其功能类似填料的色谱柱）；以正己烷为流动相A，以正己烷-正戊醇-异丙醇 （98:1:1）为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱。 第二维液相色谱：以硅胶（3mm×100mm，1.8μm）为填充剂；以正己烷-正戊醇-异丙醇（996:2:2）为流动相。取校正因子f2混合对照品溶液（1）100μl注入第一维液相色谱仪，对前维生素D峰和维生素D峰进行定位。调节第一维液相色谱流动相A和流动相B的初始比例使维生素D主峰的保留时间约25分钟，第一维液相色谱中前维生素D切换时间设为保留时间的前后各约1.5分钟；第一维液相色谱中维生素D切换时间设为维生素D出峰开始时间前和出峰完毕时间后各约1.5分钟；取校正因子f2混合对照品溶液和供试品溶液各5ml混匀，作为系统适用性溶液；取100μl注入液相色谱仪，第一维液相色谱系统中前维生素D峰与维生素D的分离度应不小于5，理论板数按维生素D峰计算应不低于2300；第二维液相色谱系统中维生素D峰与相邻峰的分离度以及前维生素D峰和相邻峰的分离度均应符合规定。 测定法 取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按第一法的计算方法计算，即得。 注：高效液相色谱仪需要双泵、双通道、双紫外检测器。一般情况下选用六通阀即可完成方法的切换过程，六通阀连接图如下。 |
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