本品系用破伤风梭状芽砲杆菌，在适宜的培养基中培养产生的毒素经甲醛脱毒、精制，加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防破伤风。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.1 名称及来源 采用破伤风梭状芽砲杆菌CMCC 64008或其他经批准的破伤风梭状芽孢杆菌菌种。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.3 种子批的传代 主种子批自启开后传代应不超过5代；工作种子批启开后至疫苗生产，传代应不超过10代。 2.1.4 种子批的检定 2.1.4.1 培养特性 本菌为专性厌氧菌，适宜生长温度为37℃。在庖肉液体培养基中培养，培养液呈浑浊、产生气体、具腐败性恶臭。在血琼脂平皿培养基培养，菌落呈弥漫生长。在半固体培养基穿刺培养，表现鞭毛动力。 2.1.4.2 染色镜检 初期培养物涂片革兰氏染色镜检呈阳性，杆形菌体，少见芽孢。48小时以后培养物涂片革兰氏染色镜检，易转为阴性，可见芽孢，菌体呈鼓槌状，芽孢位于顶端并为正圆形。 2.1.4.3 生化反应 不发酵糖类，液化明胶，产生硫化氢；不还原硝酸盐（通则3605）。 2.1.4.4 产毒试验 取培养物的滤液或离心上清液0.1ml注射于体重18~22g小鼠的尾根部皮下，至少4只。于注射后12~24小时观察小鼠，应出现尾部僵直竖起、后腿强直痉挛或全身肌肉痉挛等症状，甚至死亡。 2.1.4.5 特异性中和试验 取适量产毒培养物的滤液或离心上清液与相应稀释的破伤风抗毒素经体外中和后，注射于体重为18~22g小鼠的腹部皮下，每只小鼠注射0.4ml，至少4只；同时取未结合破伤风抗毒素的培养物的滤液或离心上清液0.4ml，注射小鼠的腹部皮下，作为阳性对照。注射后观察5天，对照组小鼠24小时内应出现明显破伤风症状并死亡，试验组小鼠在观察时间内应存活。 2.1.5 种子批的保存 种子批应冻干保存于8℃及以下；工作种子批也可2~8℃保存于液体培养基中，有效期为12个月。 2.2 类毒素原液 2.2.1 毒素 2.2.1.1 生产用种子 工作种子批检定合格后方可用于生产。 工作种子批先在产毒培养基种子管中传1~3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。 2.2.1.2 生产用培养基 采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白质成分经加深水解后的培养基。 2.2.1.3 产毒 采用培养罐液体培养，培养过程应严格控制杂菌污染，经显微镜检查或纯菌检查发现污染者应废弃。 2.2.1.4 收获 检测培养物滤液或离心上清液，毒素浓度不低于40Lf/ml时收获毒素。 2.2.2 脱毒 2.2.2.1 毒素或精制毒素的脱毒 毒素或精制毒素中加入适量甲醛溶液，置适宜温度进行脱毒，制成类毒素。 2.2.2.2 脱毒到期的类毒素应每瓶取样做絮状单位（Lf）测定。 2.2.2.3 脱毒检查 每瓶取样，用体重300~400g豚鼠至少2只，每只皮下注射500Lf。精制毒素脱毒者可事先用0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成100Lf/ml，皮下注射5ml，于注射后第7天、第14天、第21天进行观察并称体重，动物不应有破伤风症状，到期每只动物体重不得较注射前减轻，且健存者为合格。体重减轻者应加倍动物数进行复试。发生破伤风症状者，原液应继续脱毒。 2.2.2.4 类毒素应为黄色或棕黄色透明液体。 2.2.3 精制 2.2.3.1 类毒素或毒素可用等电点沉淀、超滤、硫酸铵盐析等方法或经批准的其他适宜方法精制。 2.2.3.2 类毒素精制后可加0.1g/L硫柳汞防腐，并应尽快除菌过滤。 2.2.3.3 用同一支菌种、培养基制备的类毒素，在同一容器内混合均匀后除菌过滤者为一批。 2.2.4 类毒素原液检定 按3.1项进行。 2.2.5 保存及有效期 于2~8℃保存。类毒素原液自精制之日起或先精制后脱毒的制品从脱毒试验合格之日起，原液有效期为42个月，疫苗总有效期不超过72个月。 2.3 半成品 2.3.1 佐剂配制 2.3.1.1 配制氢氧化铝可用三氯化铝加氨水法或三氯化铝加氢氧化钠法，用氨水配制需透析除氨后使用。 2.3.1.2 配制成的氢氧化铝原液应为浅蓝色或乳白色的胶体悬液，不应含有凝块或异物。 2.3.1.3 氢氧化铝原液应测定氢氧化铝及氯化钠含量。 2.3.2 吸附类毒素的配制 按适宜的方法配制，使每1ml半成品含破伤风类毒素7~10Lf，氢氧化铝含量不高于3.0mg/ml，可加0.05~0.1g/L的硫柳汞作为抑菌剂，补加氯化钠至8.5g/L。 2.3.3 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 每瓶0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含破伤风类毒素效价不低于40IU。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”的规定。 3 检定 3.1 类毒素原液检定 3.1.1 pH值 应为6.6~7.4（通则0631）。 3.1.2 絮状单位（Lf）测定 依法测定（通则3506），应符合规定。 3.1.3 纯度 每1mg蛋白氮应不低于1500Lf。 3.1.4 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.5 特异性毒性检查 每瓶原液取样，等量混合，用0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释为250Lf/ml，用体重250~350g豚鼠4只，每只腹部皮下注射2ml。于注射后第7天、第14天及第21天进行观察，局部无化脓、无坏死，动物不应有破伤风症状，到期每只动物体重比注射前增加者为合格。 3.1.6 毒性逆转试验 每瓶原液取样，用PBS（pH7.0~7.4）分别稀释至7~10Lf/ml，放置37℃ 42天，注射250~350g体重的豚鼠4只，每只皮下注射5ml，于注射后第7天、第14天及第21天进行观察并称体重，动物不得有破伤风症状，到期每只动物体重比注射前增加为合格。 3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 可选择下列一种方式进行：（1）疫苗注射动物后应产生破伤风抗体（通则3504）；（2）疫苗加入枸椽酸钠或其他适宜的试剂进行解吸附处理后做絮状试验（通则3506），应出现絮状反应；（3）疫苗经解聚液进行解吸附处理后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），应出现免疫沉淀反应。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 振摇后应为乳白色均匀悬液，无摇不散的凝块及异物。 3.3.2.2 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 pH值 应为6.0~7.0（通则0631）。 3.3.3.2 铝含量 应不高于0.52mg/剂（通则3106）。 3.3.3.3 氯化钠含量 应为7.5-9.5g/L（通则3107）。 3.3.3.4 硫柳汞含量 应不高于0.05mg/剂（通则3115）。 3.3.3.5 游离甲醛含量 应不高于0.1mg/剂（通则3207第一法）。 3.3.4 效价测定 每1次人用剂量中破伤风类毒素效价应不低于40IU（通则3504）。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.6 特异性毒性检查 每亚批取样，等量混合，用体重250~350g豚鼠4只，每只腹部皮下注射2.5ml，注射后第7天、第14天及第21天各观察1次并称体重，动物不应有破伤风症状，注射部位无化脓、无坏死，到期体重比注射前增加者为合格。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为42个月。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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