GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EKPFVAFGSG MESLVEATVG ERVRIPAKYL GYPPPEIKWY KNGIPLESNH TIKAGHVLTI MEVSERDTGN YTVILTNPIS KEKQSHVVSL VVYVPPGPGD KTHTCPLCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KATPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK 二硫键 链内：27-76 121-182 340-400 446-504 27'-76' 121'-182' 340'-400' 446'-504' 链间：305-305' 308-308' N-糖基化位点：N33、N65、N120、N193、N249、N270、N376 分子式：C5276H8298N1410O1566S36 分子量：117.6kDa 本品系由可高效表达人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、蛋白收获并纯化后获得的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白制成。不含抑菌剂和抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程细胞 2.1.1 名称及来源 康柏西普工程细胞由含有人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白基因的质粒转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞构建而成。 2.1.2 细胞库建立、传代及保存 原始细胞传代、扩增后保存于液氮或 -130℃以下，作为主细胞库。从主细胞库的细胞传代、扩增后保存于液氮或 -130℃以下，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次，细胞库检定合格后方可用于生产。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 2.1.3.1 细胞鉴别 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.2 内、外源因子检查 细菌和真菌、分枝杆菌、支原体、病毒因子检查应符合规定。 2.1.3.3 目的蛋白表达量测定 表达量应符合批准要求。 2.1.3.4 目的基因核苷酸序列检查（工作细胞库可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.2 原液 2.2.1 细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，供生物反应器接种用。 2.2.2 生产用细胞培养液 生产用细胞培养液应不含任何血清和抗生素。 2.2.3 细胞培养 采用经批准工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即“收获液”。细胞培养全过程应严格按照无菌操作。 2.2.4 分离纯化 收获液采用经批准的工艺进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的康柏西普蛋白。除菌过滤后即为康柏西普原液，保存于适宜温度，并规定其有效期。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按批准的工艺将原液用缓冲液稀释，除菌过滤后即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”有关规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”、通则0102与通则0105规定。 2.4.3 规格 2mg（0.2ml）/支 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”、通则0102与通则0105规定。 2.4.5 成品检定 按3.3项进行。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 鉴别试验 3.1.1.1 肽图 依法检查（通则3405第一法）。取供试品适量（约相当于0.2mg蛋白质），加入表面活性剂、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液和50mmol/L碳酸氢铵溶液，煮沸10分钟变性还原，冷却后加入1mol/L碘乙酰胺（IAA）溶液，室温避光封闭45分钟。用50mmol/L碳酸氢铵超滤换液，按照1∶25（mg/mg）加入测序级胰蛋白酶，37℃±1℃酶切16～20小时，加入10%三氟乙酸终止，12000g离心5分钟（2～8℃），取上清液作为供试品溶液。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：2.1mm×15cm，粒度1.8μm或其他适宜的色谱柱），柱温60℃；流速为每分钟0.2ml；检测波长214nm；取适宜体积注入超高效液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.085%三氟乙酸-乙腈溶液）。标准品同法操作。 供试品肽图应与康柏西普标准品一致。 3.1.1.2 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N端序列应为： Gly-Arg-Pro-Phe-Val-Glu-Met-Tyr-Ser-Glu-Ile-Pro-Glu-Ile-Ile。 3.1.1.3 分子量 依法检查（通则0541第五法）。使用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为10%，加样量2μg。分子量应为67.0～81.8kD。 3.1.1.4 电荷异质性 用还原固定pH梯度-等电聚焦法测定。取供试品适量（相当于0.18～0.25mg蛋白质）加入8mol/L尿素-100mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液、1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液，37℃还原3小时，冷却后加入0.5mol/L碘乙酰胺（IAA）溶液，室温避光封闭1小时。用8mol/L尿素超滤换液，之后加入溶胀液混匀后，加入电泳槽，取固定pH梯度胶条浸入其中，水化5小时。标准品同法操作。按下表程序进行等电聚焦。 供试品电荷异质性应与标准品基本一致。 3.1.2 纯度和杂质 3.1.2.1 电泳法 依法检查（通则0541第五法）。使用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为10%，加样量4μg。主峰面积百分比应不低于96.0%。 3.1.2.2 高效液相色谱法 依法检查（通则0514）。采用亲水硅胶体积排阻色谱柱（如：7.8mm×30cm，粒度5μm或其他适宜的色谱柱），流动相为20mmol/L磷酸氢二钠-150mmol/L氯化钠-200mmol/L精氨酸缓冲液，pH7.2±0.1，流速为每分钟0.5ml，检测波长280nm，上样量为50～200μg。按面积归一化法计算纯度，康柏西普主峰面积应不低于总面积的98.0%。 3.1.2.3 宿主细胞DNA残留量 依法检查（通则3407第三法）。每1mg康柏西普应不高于30pg。 3.1.2.4 宿主细胞蛋白质残留量 依法检查（通则3429），用经验证的酶联免疫吸附法测定，每1mg康柏西普应不高于30ng。 3.1.2.5 蛋白质A残留量 依法检查（通则3429），用经验证的酶联免疫吸附法测定，每1mg康柏西普应不高于20ng。 3.1.3 效价 3.1.3.1 生物学活性 依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。 3.1.3.2 相对结合活性 依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。 3.1.4 蛋白质含量 依法检查（通则0731第六法）。用消光系数法测定，以供试品缓冲液作为空白，测定供试品溶液在波长280nm处吸光度。按下列公式计算供试品蛋白质含量，蛋白质含量应不低于10.0mg/ml。 蛋白质含量（mg/ml）=（OD280×n）/（E×L） 式中：OD280为供试品溶液在波长280nm处吸光度；n为稀释倍数；E为康柏西普蛋白的消光系数，即1.175ml/（mg?cm）；L为光程（cm）。 3.1.5 糖谱 依法检查（通则0512），离子交换色谱法。取供试品适量（相当于0.8～1.0mg蛋白质），加水超滤换液，肽N-糖苷酶F（PNGase F）37℃±1℃孵育，固相萃取后真空离心干燥；处理后样品加入2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记液，65℃±1℃反应3.0～3.5小时，固相萃取后真空离心干燥，加水复溶作为供试品溶液。色谱柱为阴离子交换柱（如：2.1mm×25cm，粒度5μm或其他适宜的色谱柱）；柱温为室温；流速为每分钟0.2ml；荧光激发波长为330nm，荧光发射波长为420nm；取适宜体积供试品溶液注入超高效液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为20%乙腈水溶液，流动相B为200mmol/L甲酸铵-20%乙腈水溶液）。按照面积归一化法计算各N-糖型比例。 按下列公式计算供试品Z值，Z值应为0.80～1.50。 式中： 3.1.6 唾液酸含量 依法检查（通则0512），反相色谱法。取供试品适量（相当于1.1～1.3mg蛋白质），加水超滤换液后，加入5mol/L乙酸溶液混匀。在唾液酸对照品系列稀释液中加入5mol/L乙酸溶液混匀。上述溶液置80℃±2℃加热2.0～2.5小时，加入4，5-亚甲二氧基-1，2-邻苯二胺（DMB）标记液于50℃±1℃反应3.0～3.5小时，加水稀释标记后的供试品和对照品。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：2.lmm×15cm，粒度1.8μm或其他适宜的色谱柱）；柱温35℃；流速为每分钟0.2ml；荧光激发波长为373nm，荧光发射波长为448nm；取适宜体积供试品和对照品溶液注入超高效液相色谱仪；按下表进行等度洗脱（表中流动相A为0.1%甲酸-水溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液）。 绘制唾液酸对照品标准曲线，计算供试品唾液酸含量。每1mol康柏西普的唾液酸含量应为8.0～18.0mol。 3.1.7 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。 3.2 半成品检定 3.2.1 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。 3.2.2 无菌检查 依法检查（通则1101薄膜过滤法），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 3.3.1.1 分子结构域 依法检查（通则3402）。取标准品和供试品各1μg分别点样于三块膜上，然后分别加入标记抗KDR抗体、抗Flt-1抗体、抗IgG-Fc抗体进行特异性结合，显色。应与标准品一致。 3.3.1.2 电荷异质性 按照3.1.1.4项进行，电荷异质性应与标准品基本一致。 3.3.2 纯度 按照3.1.2.2项进行，纯度应不低于95.0%。 3.3.3 效价 3.3.3.1 生物学活性 依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。 3.3.3.2 相对结合活性 依法检查（通则3535），应为标准品的60%～140%。 3.3.4 蛋白质含量 按照3.1.4项进行，应为9.0～11.0mg/ml。 3.3.5 理化检定 3.3.5.1 外观 应为无色的澄明液体。 3.3.5.2 可见异物 依法检查（通则0904第一法），应符合规定。 3.3.5.3 不溶性微粒检查 依法检查（通则0903第一法）。以下测试均应在层流条件和适宜的微粒分析仪中进行，测试过程应注意不得引入外来微粒，同时应避免气泡对测试结果的干扰。取微粒检查用水依法至少测定6次，每次进样体积设为1ml，弃第一次测定数据。后续每次测定均应满足：每1ml中≥10μm的不溶性微粒≤1粒，≥25μm的不溶性微粒＜1粒。取供试品混匀，釆用经确认的方法脱气，依法至少测定4次，每次进样体积不少于1ml，弃第一次测定数据，取后续测定数据的平均值作为测定结果。每1ml供试品中，含10μm及10μm以上的微粒数不得过50粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过5粒，含50μm及50μm以上的微粒数不得过2粒。 3.3.5.4 装量 依法检查（通则0102），用称重法测定，应不少于标示量。 3.3.5.5 pH值 依法检查（通则0631），应为7.4～8.0。 3.3.5.6 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应为240～360mOsmol/kg。 3.3.6 聚山梨酯20含量 若工艺中添加聚山梨酯20，使用比色法测定。取适当稀释后的供试品溶液200μl加入5ml乙醇-氯化钠饱和溶液混匀，离心取上清液，用气体吹扫法干燥后加1ml水复溶。取1mg/ml聚山梨酯20对照品溶液0、25μl、50μl、75μl、100μl、150μl、200μl各加入1ml水中，混匀。上述溶液各加入2ml二氯甲烷和3ml硫氰铵钴溶液，弃上层溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长620nm处测定下层溶液吸光度值。用二氯甲烷作为空白对照。以上述聚山梨酯20对照品溶液系列浓度对其相应的吸光度值作直线回归，相关系数应不低于0.98，将供试品吸光度值代入直线回归方程，求得供试品聚山梨酯20含量。聚山梨酯20含量应为250～750μg/ml。 3.3.7 精氨酸含量 若工艺中添加精氨酸，依法检查（通则0512），反相色谱法。取适当稀释后的供试品溶液200μl加入800μl甲醇，10000g离心15分钟，取上清液与邻苯二甲醛溶液进行衍生反应。精氨酸对照品系列稀释溶液同法操作。色谱柱为碳十八反相色谱柱（如：4.6mm×15cm，粒度3.5μm或其他适宜的色谱柱）；柱温40℃；流速为每分钟1ml，检测波长为338nm；按下表梯度洗脱（表中流动相A为pH7.8的40mmol/L NaH2PO4水溶液，流动相B为甲醇∶乙腈∶水为45∶45∶10的溶液）。 绘制精氨酸对照品标准曲线，计算供试品精氨酸含量。精氨酸含量应为80～120mmol/L。 3.3.8 无菌检查 依法检查（通则1101薄膜过滤法），应符合规定。 3.3.9 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），应小于0.4EU/ml。 3.3.10 异常毒性检查 依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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