第一法 细胞/动物/鸡胚感染试验法 鼠源性单克隆抗体制品具有潜在病毒污染，如出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、Ⅲ型呼肠孤病毒、仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中，前4种病毒属I组，为能够感染人与灵长类动物的病毒；后4种属Ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人的病毒，但能在体外培养的人源、猿源和猴源性细胞中进行复制，对人类具有潜在危险性，这些病毒应作为重点进行检测。 本法用于杂交瘤细胞株及鼠源性单克隆抗体制品的鼠源性病毒检测。通过细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等检测活病毒抗原及病毒抗体。 试剂 （1）0.01mol/L pH7.4 PBS 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)2.9g，磷酸二氢钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml。 （2）pH9.6包被缓冲液 称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g，加水溶解并稀释至l000mL。 （3）0.01mol/L pH7.4 PBS洗液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)2.9g.磷酸二氢钠0.295g、氯化钠8.5g、聚山梨酯80 5ml，加水溶解并稀释至1000ml。 （4）底物缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)12.9g、枸橼酸3.26g，加水溶解并稀释至700ml。 （5）底物溶液 称取邻苯二胺4mg，溶于底物缓冲液10ml中，再加入30%过氧化氢4μl。 （6）终止液 lmol/L硫酸溶液。 供试品的制备 供试品包括杂交瘤细胞株、腹水和单克隆抗体半成品或成品。杂交瘤细胞株应进行细胞试验、动物抗体产生试验和鸡胚感染试验；腹水和单克隆抗体半成品或成品应进行动物抗体产生试验和鸡胚感染试验。 (1)细胞试验用的供试品 取3瓶生长良好的杂交瘤细胞，于-40℃反复冻融3次后，在无菌条件下合并分装小管，每管3ml，换上胶塞，-40℃保存。 （2）动物抗体产生试验用的供试品 腹水、单克隆抗体半成品或成品，不需处理，-20℃保存。而杂交瘤细胞按下述步骤进行处理后使用。 取7瓶生长良好的杂交瘤细胞，弃去培养液，用PBS轻轻将细胞吹打下来，移入小管，再用PBS冲洗细胞瓶，以收集残余的细胞，于小管中洗涤，以每分钟1000转离心10分钟，弃去上清液，用PBS重新悬浮细胞；以上步骤重复2次。细胞集中后，悬浮于4mlPBS中，冻融3次，超声处理。以每分钟10000转离心30分钟，吸取上清液，以每分钟40000转离心4小时，弃上清液，将沉淀溶于适量的PBS中，即为动物抗体产生试验用抗原，-40℃保存。 检查法 检查方法包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等。 A.细胞试验 用已知病毒抗体检查供试品中未知病毒抗原。 (1)细胞培养 根据被检的病毒，选择其敏感的细胞。每种细胞6瓶，细胞应生长良好。用0.01mol/L pH7.4 PBS洗涤细胞2次。每瓶接种供试品0.3ml，每批供试品接种4瓶，另外2瓶为对照。37℃吸附1小时，弃去吸附的供试品液体，加入细胞维持液。每天观察细胞形态，并记录结果。接种后每隔3～4天换1次液。第一代细胞应维持10～14天。冻融3次后，将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并。将收获的对照组和供试品组的细胞悬液分别接种同种细胞，接种后，每隔3～4天，换1次液。 (2)涂片 培养至10～14天，吸出维持液，再用PBS洗细胞2次，每瓶加消化液0.15ml，使细胞分散、脱壁，吸出细胞悬液，再用PBS洗涤2次。用适量的PBS悬浮细胞，将对照组的正常细胞涂在抗原片的第一行，供试品组的细胞涂在第二行，吹干，丙酮固定，-40℃保存，即为供试品细胞涂片。 (3)间接免疫荧光法检测 制备已知病毒抗原片，将已知特异性阳性血清和阴性血清进行1：(5～20)的稀释；应用制备的已知病毒抗原片作为血清对照，检查供试品细胞涂片。将涂有供试品细胞的玻片，加经PBS 10倍稀释的已知阳性血清、阴性血清，置湿盒中，37℃放置30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡5分钟，待干燥后，滴加荧光抗体，37℃保温30分钟后，再用PBS洗涤3次，每次浸泡5分钟，再用水洗1次，待干燥后，加50%甘油，用盖玻片封好，镜检。 (4)结果判定 在已知病毒抗原片上，阴性对照血清与正常细胞孔、病毒细胞孔均无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光而与病毒细胞孔有荧光反应；在供试品细胞涂片上，当阴性对照血清与正常细胞孔、供试品细胞孔无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光时，试验成立。阴性对照血清与正常细胞孔和供试品细胞孔有荧光反应或阳性对照血清与正常细胞孔有荧光反应，试验不成立。供试品细胞涂片上，阳性对照血清与供试品细胞孔有荧光，判为阳性。 B.动物抗体产生试验 (1)供试品抗体的制备每批供试品按下表参数注射无特定病原体小鼠(BALB/c或KM)共50只。 (2)血清学检查 对经肌内注射和腹腔注射的供试品组和对照组小鼠分别采血，分离血清后用ELISA法检测抗体。包被病毒抗原和正常细胞抗原，每孔0.1ml，置37℃、1小时后，放4℃过夜，用ELISA试剂盒的洗液充分洗涤，拍干。每份供试品分别加入病毒抗原孔和正常细胞抗原孔各1个，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。加酶结合物，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。每孔加入底物溶液0.lml，37℃培养10～20分钟，当阳性对照血清孔出现颜色、阴性对照血清孔无颜色时，每孔加入lmol/L硫酸溶液0.1ml终止反应，测吸光度。 (3)结果判定 P/N值不小于2.0为阳性；P/N值小于2.0为阴性。 P为供试品免疫小鼠血清与病毒抗原的吸光度减去供试品免疫小鼠血清与正常细胞抗原的吸光度； N为对照组动物血清与病毒抗原的吸光度减去对照组动物血清与正常细胞抗原的吸光度。 C.鸡胚感染试验 于接种前24小时观察鸡胚。活鸡胚具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可看到胚动。死胚血管暗昏模糊，没有胚动。接种前用检卵灯再次检查鸡胚活力，并标出气室和胚胎的位置。按无菌操作要求，以卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿囊膜途径接种供试品。接种后，每日观察，培养5天。无菌操作收集卵黄囊、绒毛尿囊膜和尿囊液。卵黄囊和绒毛尿囊膜经研磨后，离心，取上清液，与尿囊液分别用豚鼠或鸡红细胞做血凝试验。 取每排8孔微量血凝反应板，从第2孔至第8孔每孔加0.85%～0.90%氯化钠溶液50μl第1、2孔各加经上述处理的供试品50μl，然后从第2孔吸取50μl至第3孔、第3孔吸取50μl至第4孔……(以此类推)进行倍比稀释，至第7孔时丢弃50μl；第8孔为对照孔。第1孔至第8孔各加1%豚鼠红细胞悬液50μl，混匀。做2块反应板，分别静置于4℃和室温，至对照孔呈现明显阴性(一)时判定结果。 结果判定： ++++ 红细胞均匀铺于孔底； +++ 红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐，有下滑趋向； ++ 红细胞于孔底形成小环，但周围有小凝集块； + 红细胞于孔底形成小团，边缘可见少许凝集块； - 红细胞集中在孔底中央，呈一边缘致密的红点。 以凝集反应出现“++'或'++”以上者判为阳性。 第二法 荧光定量PCR法 本法将提取的供试品RNA逆转录成cDNA后，或用提取的供试品DNA，针对8种外源性鼠源性病毒设计特异性引物探针，进行荧光定量PCR检测特异性扩增信号，从而测定供试品中外源性鼠源性病毒核酸序列，以检查供试品的外源性鼠源性病毒污染。 试剂 (1) RNA/DNA提取试剂 RNA/DNA的提取可使用酚-氯仿(三氯甲烷)法、磁珠法、离心柱法等。提取试剂中应含裂解液、洗涤液、洗脱液等，按试剂说明书要求配制。 (2)逆转录试剂 含逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP混合液、随机引物、逆转录反应缓冲液等，按试剂说明书要求配制。 (3)引物序列、探针序列 见下表。 (4)扩增缓冲液 每20μl反应体系中，含有上、下游引物各5pmol，探针2.5pmol及适量荧光定量PCR混合液(Mix)。 (5)质粒标准品稀释液 为DNA稀释缓冲液或经无RNA酶水所稀释。 (6)对照溶液 以失活无感染性的鼠源性病毒为阳性对照。以无RNA酶水作为阴性对照。提取核酸和逆转录步骤同“(1)RNA/DNA提取试剂”，置-70℃保存备用。 (7)质粒标准品溶液及灵敏度对照的制备 选择病毒目的核酸序列，人工合成DNA，目的序列转入pMD 19-T质粒中，作为质粒标准品。测定质粒标准品的DNA核酸浓度后，对其进行10倍的倍比稀释，从(2×109)Copies/μl稀释至(2×100)Copies/μl。 取(2×107)～(2×103)Copies/μl质粒标准品溶液作标准曲线各点。(2×101)Copies/叫稀释度作为灵敏度对照。置冰浴备用。 供试品的制备 参照第一法“供试品的制备'(1)和(2)。 供试品用于核酸提取的模板量不少于0.2ml。 检查法 (1)核酸提取及逆转录取供试品和阴性、阳性对照，各3个重复，按照DNA/RNA试剂盒的使用说明书提取DNA/RNA。 按照逆转录试剂盒的使用说明书将RNA逆转录为cDNA。 (2)荧光定量PCR扩增 反应总体积为20μl。取DNA或cDNA 5μl加至预先配制好的15μl荧光定量PCR扩增缓冲液中，使反应总体积为20μl。各3个重复，混匀后，按下列条件进行扩增：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 15秒；60℃ 1分钟……共40个循环。在60℃采集信号。 结果判定 (1)灵敏度检查分别检测(2×101)Copies/μl和(2×100)Copies/μl供试品，各10个重复。至少(2×101)Copies/μl灵敏度对照应全部检出(10/10)，则灵敏度检查合格。 (2)试验有效性 标准曲线相关系数(R2)应不低于0.990，阳性对照应为阳性，Ct 值应≤32，并呈明显的扩增曲线；灵敏度对照应为阳性，Ct 值应≤35；阴性对照应为阴性，Ct 值＞35，无明显的扩增曲线；则试验有效。 (3)供试品结果判定 如果供试品的Ct 值≤35，同时拷贝数≥20，且有明显的扩增曲线，则判定供试品外源性鼠源性病毒为阳性。否则为阴性。供试品结果出现阳性时，需使用第一法仲裁。 注意事项 (1)质粒标准品稀释时，用新吸头吸取上一个稀释度样本加至下一个稀释管中，涡旋混匀；然后用新吸头进行下一个稀释。 (2)试验中所有吸头均需无菌，与供试品有关的操作建议使用带滤芯吸头。 (3)注意实验分区，定期对各区进行消毒。 |
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