本品系从矛头蝮蛇（Bothrops Atrox）蛇毒中提取的具有止血作用的蛋白酶类物质。每1mg中含矛头蝮蛇血凝酶活力不得少于800单位，每1mg蛋白质中含矛头蝮蛇血凝酶活力不得少于2500单位。 【制法要求】本品系从检验合格的矛头蝮蛇蛇毒（见附）中经透析、特异性亲和色谱等多种色谱方法分离提取，并经冷冻干燥制得。生产过程应符合现行版《药品生产质量管理规范》的要求。 【性状】本品为白色冻干块状物或粉末；无味。 本品在水中易溶。 【鉴别】（1）取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含100μg的溶液，作为供试品溶液；取小试管，加入凝血质控血浆混悬液［凝血质控血浆（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水1.0ml，放置15分钟，期间间或轻摇，每次使用前轻轻摇匀］0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中2分钟，加供试品溶液0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中振摇，观察，血浆应在10秒内出现白色絮团。 （2）取试管1支，加0.4mol/L碳酸钠溶液1ml、鉴别（1）项下的供试品溶液1ml与0.1mol/L福林试液1ml，置37℃士0.5℃水浴中20分钟，溶液应呈蓝色。 （3）取本品与矛头蝮蛇血凝酶对照品适量，分别加水溶解并制成适宜浓度的溶液，作为供试品溶液与对照品溶液，依法测定（通则3405第一法），供试品溶液的图谱应与对照品溶液的图谱一致。 （4）照电泳法（通则0541第五法，还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）测定。 取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含蛋白质1mg的溶液，作为供试品储备液；取此储备液30μl，加还原型供试品缓冲液10μl，混匀，置沸水浴中加热5分钟，作为供试品溶液；取矛头蝮蛇血凝酶对照品适量，同法制备对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各15μl，分别加至上样孔，分离胶浓度为12.5%，用考马斯亮蓝R250染色，供试品溶液主带的迁移率应与对照品溶液主带的迁移率一致。 【检查】纯度 （1）照电泳法（通则0541第五法，非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）测定。 取鉴别（4）项下供试品储备液30μl，加非还原型供试品缓冲液10μl，混匀，置沸水浴中加热5分钟，作为供试品溶液。取供试品溶液15μl，加至上样孔，分离胶浓度为12.5%，用考马斯亮蓝R250染色，应显示一条带。 （2）照高效液相色谱法（通则0512）测定。 供试品溶液 取本品，加流动相A溶解并制成每1ml中约含蛋白质1mg的溶液。 色谱条件 用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺水溶液为流动相A，以0.1%三氟乙酸的0.1%三乙胺乙腈溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为280nm；进样体积50μl。 测定法 取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。 限度 按峰面积归一化法计算，矛头蝮蛇血凝酶主峰面积应不低于总峰面积的95.0%。 分子量 照电泳法（通则0541第五法，还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）测定。 取鉴别（4）项下的供试品溶液与分子量对照品溶液（系列标准蛋白质分子量范围为10K～120K，照说明书使用），照鉴别（4）项下的方法测定。本品分子量应为36000±3000。 磷脂酶A 照紫外-可见分光光度法（通则0401）测定。 供试品溶液 取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含10单位的溶液。 对照溶液 取磷脂酶A（蜂毒），加水制成每1ml中含3.6单位的溶液。 测定法 取37℃预热的卵磷脂溶液（取卵磷脂0.67g，加水适量，溶解成胶体溶液后，调节pH值至8.95，加水至100ml）2ml，置1cm吸收池中，加37℃水浴中预热的供试品溶液或对照溶液1ml，混匀，以水代替供试品溶液，同法操作，作为空白。在546nm的波长处分别测定吸光度为A1和As1，再于37℃+0.5℃水浴中保温10分钟，分别测定吸光度为A2和AS2。 限度 供试品溶液吸光度增加值不得大于对照溶液吸光度增加值（即每1单位供试品中磷脂酶A含量不得大于0.36单位）。 单位定义：在37℃、pH8.5条件下，每分钟使1.0μmol的L-α-磷脂酰胆碱（L-α-卵磷脂）水解成L-α-溶血磷脂胆碱和一个脂肪酸的酶量定义为1单位。 L-氨基酸氧化酶 照紫外-可见分光光度法（通则0401）测定。 供试品溶液 取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含10单位的溶液。 对照溶液 取L-氨基酸氧化酶（东部菱背响尾蛇），加水制成每1ml中含0.056单位的溶液。 测定法 取37℃预热的亮氨酸溶液［取亮氨酸0.1g，3，3-二甲氧基联苯胺6.5mg，加三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液（取三羟甲基氨基甲烷1.21g，置烧杯中，加水60ml溶解，用6mol/L HCl溶液调节pH值至7.6，转移至100ml量瓶中，用水稀释至刻度）溶解并稀释至100ml］2.97ml，置1cm吸收池中，加37℃预热的过氧化物酶溶液（取过氧化物酶10mg，加水溶解至10ml，临用时配制）10μl，分别加入供试品溶液或对照溶液20μl，混匀；以水代替供试品溶液，同法操作，作为空白。在436nm的波长处分别测定吸光度为A1和AS1，再于37℃±0.5℃水浴中保温5分钟，分别测定吸光度为A2和AS2。 限度 供试品溶液吸光度增加值不得大于对照溶液吸光度增加值（即每1单位供试品中L-氨基酸氧化酶含量不得大于0.0056单位）。 单位定义：在37℃、pH6.5条件下，每分钟使1.0μmol的L-氨基酸氧化脱氨基的酶量定义为1单位。 磷酸酶 照紫外-可见分光光度法（通则0401）测定。 供试品溶液 取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含10单位的溶液。 对照溶液 取磷酸酶（小麦胚），加水制成每1ml中含0.03单位的溶液。 测定法 取0.165%对硝基苯磷酸二钠溶液（pH8.5）1ml，分别加入供试品溶液或对照溶液0.1ml，置37℃士0.5℃水浴中保温30分钟，再加0.02mol/L氢氧化钠溶液10ml，摇匀；以水代替供试品溶液，同法操作，作为空白。在400nm的波长处分别测定吸光度。 限度 供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液吸光度（即每1单位供试品中磷酸酶含量不得大于0.003单位）。 单位定义：在37℃、pH4.8条件下，每分钟水解1.0μmol的对硝基苯磷酸二钠的酶量定义为1单位。 神经毒 取本品，加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含2单位的溶液，作为供试品溶液。取体重为300～500g的鸽子3只，每1kg体重注射供试品溶液0.5ml，静脉给药，观察24小时。动物不得出现神经行为异常，如步态不稳，翻正反射消失，前后肢握力减弱，抽搐，颈项强直等，或死亡；如3只鸽子中有一只出现上述神经行为异常或死亡，应另取鸽子5只复试，均不得出现神经行为异常或死亡。 出血毒 取本品，加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含50单位的溶液，作为供试品溶液。取体重18～22g的小白鼠5只，每只一侧背部皮下注射0.2ml，另一侧注射氯化钠注射液0.2ml作对照，注射24小时后处死动物，剥皮观察，与对照部位相比，小鼠背部均不得有出血现象。 细菌内毒素 取本品，依法测定（通则1143），每1单位矛头蝮蛇血凝酶中含内毒素的量应小于50EU。 异常毒性 取本品，加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含1.0单位的溶液，依法测定（通则1141），按静脉注射法给药，应符合规定。 【效价测定】酶活力 标准品溶液取1支矛头蝮蛇血凝酶标准品（供效价测定用），精密加水1ml使溶解并定量稀释制成每1ml中各约含0.2、0.5、1.0、2.0、3.0单位的溶液。 供试品溶液 精密称取本品适量，加水溶解并定量稀释制成每lml中约含1.0单位的溶液。 测定法 取凝血质控血浆混悬液［凝血质控血浆（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水2.0ml，放置15分钟，期间间或轻摇，每次使用前轻轻摇匀］0.1ml，分别加入20支试管中并置凝血分析仪中，37℃士0.5℃条件下预热2分钟，精密量取系列浓度的标准品溶液各0.2ml，迅速加入上述各试样管中，记录凝固时间，每种浓度重复测定4次，计算平均值（4次测定最大值与最小值之差不得超过平均值的10%，否则重测）。以标准品溶液浓度的对数为横坐标，凝固时间对数为纵坐标，计算线性回归方程（相关系数应大于0.99）。 取供试品溶液，照上法测定，从回归方程求得供试品溶液浓度，并计算每1mg中矛头蝮蛇血凝酶活力。 矛头蝮蛇血凝酶单位定义：37℃+0.5℃条件下，每0.2ml酶溶液使0.2ml凝血质控血浆混悬液，在58～62秒出现白色絮团的酶量，以酶溶液的浓度计，定义为每1ml酶溶液中含矛头蝮蛇血凝酶1个单位。 蛋白质 取本品适量，精密称定，照蛋白质含量测定法（通则0731第二法）测定，计算每1mg中蛋白质的量（mg）。 比活力 本品矛头蝮蛇血凝酶活力单位除以蛋白质的量（mg），即得。 【类别】止血药。 【贮藏】遮光，冷处保存。 【制剂】注射用矛头蝮蛇血凝酶 附： 矛头蝮蛇蛇毒 Maotoufushe Shedu Bothrops Atrox Venom 本品为矛头蝮蛇（Bothrops Atrox｝毒液经冷冻干燥而成，主要活性成分为蛋白水解酶。按干燥品计算，含蛋白质应不少于70%。4μg蛇毒应能使0.2ml血浆在60秒内出现白色絮团。 【制法要求】本品系自矛头蝮蛇（Bothrops Atrox）腮腺中，以挤压刺激的方法采集蛇毒毒液，并经冷冻干燥制得。生产过程应参考现行版《药品生产质量管理规范》要求，并按照相应标准操作规程执行。 【性状】本品应为类白色至黄色结晶或粉末。 【鉴别】（1）取本品10mg，加水5ml溶解，作为供试品溶液；取小试管，加入凝血质控血浆混悬液［凝血质控血浆（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水1.0ml，放置15分钟，期间间或轻摇，每次使用前轻轻摇匀］0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中2分钟，加供试品溶液0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中振摇，观察，血浆应在10秒内出现白色絮团。 （2）取本品10mg，加水5ml溶解，取1ml置试管中，加0.4mol/L碳酸钠溶液1ml与0.1mol/L福林试液1ml，置37℃水浴中2分钟，溶液应呈蓝色。 【检查】干燥失重 取本品约0.50g，精密称定，以五氧化二磷为干燥剂，60℃减压干燥4小时，减失重量不得过10%（通则0831）。 【活性成分含量】蛋白质 取本品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，照蛋白质含量测定法（通则0731第二法）测定，计算，即得。 活性成分 取蛋白质项下的供试品溶液，精密量取1ml，置5ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取凝血质控血浆混悬液［凝血质控血浆（MDC Hemostasis）放至室温，每支加水1.0ml，放置15分钟，期间间或轻摇，每次使用前轻轻摇匀］0.2ml，置小试管中，37℃士0.5℃水浴中保温3分钟，加入供试品溶液0.2ml，立即摇匀，同时计时，于37℃士0.5℃水浴中振摇。应在60秒内出现白色絮团。 【贮藏】遮光，冷处保存。 |
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