本法系采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）紫外检测方法，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，按毛细管电泳法（通则0542），定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。 毛细管电泳系统 (1)检测器紫外或二极管阵列检测器。波长：214nm或220nm。 (2)毛细管 非涂层-熔融石英毛细管(内径50μm)，选择合适长度以满足系统适用性要求。 试剂 (1)SDS样品缓冲液 含1%SDS的0.04mol/L磷酸盐溶液(pH6.5)或等效缓冲液。 (2)SDS凝胶分离缓冲液 含0.2%SDS的缓冲液(pH8.0)，含有适当的亲水性聚合物作为分子筛或等效缓冲液。 (3)0.1mol/L或其他适宜浓度盐酸溶液。 (4)0.1mol/L或其他适宜浓度氢氧化钠溶液。 (5)2-疏基乙醇。 (6)烷基化溶液 0.8mol/L的碘乙酰胺水溶液，可称取约74mg碘乙酰胺，加入500μl超纯水溶解，新鲜制备，避免光照。 (7)系统适用性对照品溶液 终浓度1mg/ml。 供试品制备 (1)供试品溶液制备 用SDS样品缓冲液将供试品稀释至1mg/ml。样品缓冲液以相同稀释倍数稀释，为空白对照。 (2)非还原供试品溶液制备 取供试品溶液(lmg/ml)95μl，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μl，涡旋混匀。取空白对照95μl，加入0.8mol/L碘乙酰胺水溶液5μl，涡旋混匀，为非还原空白对照。 (3)还原供试品溶液制备 取供试品溶液(1mg/ml)95μl，加入2-疏基乙醇5μl，涡旋混匀。取空白对照95μl，加入2-巯基乙醇5μl，涡旋混匀，为还原空白对照。 将供试品溶液和空白对照在68～72℃孵育，非还原供试品溶液孵育5分钟，还原供试品溶液孵育15分钟。冷却至室温后每分钟6000转离心1分钟。从样品管中分别取出75μl至样品瓶中，立即进行分析。 系统适用性 (1)还原条件的系统适用性要求 电泳图谱：系统适用性对照品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度：糖基化重链峰和非糖基化重链峰能够明显地分辨(分离度根据实际测定数据设定)。 系统适用性对照品非糖基化重链占总重链的百分比：以非糖基化重链的修正峰面积占总重链的修正峰面积的百分比计算。系统适用性对照品溶液中非糖基化重链占总重链的百分比应在指定范围内(见该批次对照品说明书)。 迁移时间：两针系统适用性对照品重链迁移时间差≤1.0分钟。 空白：空白溶液中应无干扰峰。 (2)非还原条件的系统适用性要求 电泳图谱：系统适用性对照品溶液的电泳图谱应与提供的典型电泳图谱相一致。 分离度：IgG主峰与片段峰的分离度根据实际测定数据设定。 系统适用性对照品主峰百分比：以主峰的修正峰面积占总修正峰面积的百分比计算。系统适用性溶液主峰的相对百分含量应在指定范围内(见该批次对照品说明书)。 迁移时间：两针系统适用性对照品主峰的迁移时间差≤1.0分钟。 测定法 毛细管的预处理：0.1mol/L氢氧化钠溶液在60psi压力下冲洗3分钟，然后用0.1mol/L盐酸溶液在60psi压力下冲洗2分钟，最后用纯水在70psi压力下冲洗1分钟，每次运行前应进行。 毛细管的预填充：SDS凝胶分离缓冲液在50psi压力下冲洗15分钟，每次运行前应进行。 样品进样：10kV反相极性电动进样。还原样品进样30秒，非还原样品进样40秒。 分离：15kV下运行40分钟，反相极性。 样品室温度：18～22℃。 毛细管温度：18～22℃。 进样顺序：空白、系统适用性对照品、样品、系统适用性对照品、空白。 注：根据仪器的不同，可调节毛细管种类和测定法的条件，以满足系统适用性要求。 结果分析 (1)还原条件按面积归一化法计算，以重链、非糖基化重链和轻链的修正峰面积分别占所有修正峰面积之和的百分比分别计算重链、非糖基化重链和轻链的纯度，三者之和即为产品纯度(图1)。(注：根据样品功能决定是否包含非糖基化重链纯度) (2)非还原条件 按面积归一化法计算，以IgG主峰的修正峰面积占所有修正峰面积之和的百分比计算主峰的纯度(图2)。 |
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