本品系用乙型脑炎（简称乙脑）病毒减毒株接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂冻干制成。用于预防乙型脑炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。SPF地鼠特定病毒检查除应符合生物制品生产及检定用实验动物质量控制（通则3601）外，亦不得检出小鼠肝炎病毒、小鼠细小病毒、小鼠脊髓灰质炎病毒、仙台病毒、汉坦病毒、猴病毒5、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、大鼠K病毒、吐兰病毒、地鼠多瘤病毒、逆转录病毒。 2.1.1 细胞管理及检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 2.1.2 细胞制备 选用10~14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，置适宜温度下培养。细胞生长成致密单层后接种病毒。来源于同一批地鼠、同一容器内消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批；源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。 2.2 毒种 2.2.1 名称及来源 生产用毒种为乙脑病毒SA14-14-2减毒株或其他经批准的减毒株。 2. 2. 2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 原始种子传代应不超过第6代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第9代，生产的疫苗应不超过第10代。 2.2.3 种子批毒种的检定 主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1~2.2.3.5项检定。 2.2.3.1 鉴别试验 将毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度分别与非同源性乙脑特异性免疫血清和乙脑阴性血清混合，置37℃水浴90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5~7天判定结果。中和指数应大于1000。 2.2.3.2 病毒滴定 将毒种做10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于7.2 lg PFU/ml。 2.2.3.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 2.2.3.4 分枝杆菌检查 以草分枝杆菌（CMCC 95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3~5天收集培养物，以0.9%氯化钠溶液制成菌悬液，采用细菌浊度法确定菌含量，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌量约为2×107CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。 供试品小于1ml时采用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook 7H10培养基），每种培养基做3个重复。并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。 供试品大于1ml时采用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基、培养时间及结果判定同上。 2.2.3.5 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 2.2.3.6 外源病毒因子检查 依法检查（通则3302），应符合规定。 2.2.3.7 E蛋白基因稳定性试验 以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变（E-107：苯丙氨酸，E-138：赖氨酸，E-176：缬氨酸，E-177：丙氨酸，E-264：组氨酸，E-279：甲硫氨酸，E-315：缬氨酸，E-439：精氨酸）。 与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核苷酸序列的同源性应不低于99.6%。 2.2.3.8 免疫原性检查 用主种子批毒种制备疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度，分别免疫体重为10~12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml，接种后3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%），攻击后14天判定结果。ED50应不高于3.0 lg PFU，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。 2.2.3.9 猴体神经毒力试验 用冻干主种子批进行猴体神经毒力试验（病毒滴度不低于5.7 lg PFU/ml），分别注射2~3.5岁10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml、腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14株稀释成102PFU/ml和103PFU/ml病毒量，以同法接种恒河猴，每个稀释度注射4只恒河猴。试验用恒河猴乙脑抗体应为阴性。 对SA14-14-2减毒组的10只恒河猴观察至少21天，应无任何特异性乙脑发病症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后在观察期内病毒量103PFU/ml组4只恒河猴应全部特异性死亡；病毒量为102PFU/ml组的4只恒河猴，至少应有2只死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。 2.2.3.10 脑内致病力试验 用种子批毒种接种17~19日龄小鼠，至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察14天应存活。接种后3天内死亡者不计（动物死亡数量应不得超过试验动物总数的20%）。3天后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0 lg LD50/0.03ml，同时以10-1病鼠脑悬液皮下注射17~19日龄小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。 2.2.3.11 皮下感染入脑试验 用种子批毒种接种17~19日龄小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应全部健存。 2.2.3.12 乳鼠传代返祖试验 用病毒滴度不低于7.2 lg PFU/ml（液体毒种）或不低于5.7 lg PFU/ml（冻干毒种）的种子批毒种接种3~5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。取最早发病的3只乳鼠处死，解剖取脑，用17~19日龄小鼠测其致病力，脑内毒力应不高于3.0 lg LD50/0.03ml，同时以10-1的发病乳鼠脑悬液皮下注射17~19日龄小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。 2.2.4 毒种保存 毒种应于-60℃以下保存。 2.3 原液 新制备的种子批用于生产时，连续制备的前三批疫苗原液应对E蛋白基因区核苷酸序列进行测定，与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核苷酸序列的同源性应不低于99.6%，8个关键位点氨基酸的核苷酸序列不能改变。 2.3.1 细胞制备 按2.1.2项进行。 2.3.2 培养液 采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604），且乙脑抗体应为阴性。 2.3.3 对照细胞外源病毒因子检查 依法检查（通则3302），应符合规定。 2.3.4 病毒接种和培养 挑选生长致密的单层细胞，接种病毒进行培养，病毒接种量及培养条件按批准的执行。 2.3.5 病毒收获 种毒后经培养至病毒增殖的适宜阶段收获病毒液。检定合格的同一细胞批的同一次病毒收获液可合并为单次病毒收获液。 2.3.6 单次病毒收获液保存 于2~8℃保存不超过30天。 2.3.7 单次病毒收获液合并 检定合格的同一细胞批生产的多个单次病毒收获液，经澄清过滤，合并为1批原液。 2.3.8 原液检定 按3.2项进行。 2.4 半成品 2.4.1 配制 将原液按规定的同一病毒滴度适当稀释，加入适宜稳定剂即为半成品，每批半成品总量不得超过150L。 2.4.2 半成品检定 按3.3项进行。 2.5 成品 2.5.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.5.2 分装及冻干 应符合 “生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.5.3 规格 按标示量复溶后每瓶0.5ml、1.5ml、2.5ml。每1次人用剂量为0.5ml，含乙脑活病毒应不低于5.4 lg PFU。 2.5.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 单次病毒收获液检定 3.1.1 病毒滴定 按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.0 lg PFU/ml。 3.1.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.3 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 3.2 原液检定 3.2.1 病毒滴定 按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.0 lg PFU/ml。 3.2.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.3 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 3.2.4 逆转录酶活性检查 按本品种附录进行，应为阴性。 3.3 半成品检定 3.3.1 病毒滴定 按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.8 lg PFU/ml。 3.3.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.4 成品检定 除水分测定外，按标示量加入所附疫苗稀释剂，复溶后进行以下各项检定。 3.4.1 鉴别试验 按2.2.3.1项进行。 3.4.2 外观 应为淡黄色或淡粉色疏松体，复溶后为橘红色或淡粉红色澄明液体，无异物。 3.4.3 水分 应不高于3.0%（通则0832）。 3.4.4 pH值 依法检查（通则0631），应符合批准的要求。 3.4.5 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应符合批准的要求。 3.4.6 病毒滴定 按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml。 3.4.7 稳定性试验 应由生产单位在成品入库前取样测定，应与病毒滴定同时进行。于37℃放置7天，按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml，病毒滴度下降应不高于1.0 lg。 3.4.8 牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（通则3411）。 3.4.9 抗生素残留量 生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。 3.4.10 安全试验 3.4.10.1 脑内致病力试验 按2.2.3.10项进行。 3.4.10.2 乳鼠传代返祖试验 按2.2.3.12项进行。 3.4.11 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.4.12 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 3.4.13 细菌内毒素检查 应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）。 4 疫苗稀释剂 疫苗稀释剂为灭菌注射用水或灭菌PBS，稀释剂的生产应符合批准的要求。灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关规定。 灭菌PBS的检定 4.1 外观 应为无色澄明液体。 4.2 可见异物检查 依法检查（通则0904），应符合规定。 4.3 pH值 应为7.2~8.0（通则0631）。 4.4 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 4.5 细菌内毒素检查 应不高于0.25EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。 5 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月。 6 附录 逆转录酶活性检查法。 7 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 附录 逆转录酶活性检查法 本法系采用PERT法通过以噬菌体MS2 RNA为模板，在外源逆转录酶作用时产生cDNA，再经PCR法扩增后，以电泳法分析扩增产物，检查供试品中逆转录酶活性。 试剂 1. 噬菌体MS2 RNA寡核苷酸引物 RT-1：5'-d（CATAGGTCAAACCTCGTAGGAATG）-3' RT-2：5'-d（TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG）-3' 2. 模板 噬菌体MS2 RNA。 3. 逆转录体系 （1）模板引物基本反应体系 0.28pmol/μl的噬菌体MS2 RNA 0.5μl 10pmol/μl引物RT-1 0.5μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水 0.4μl （2）逆转录反应体系 逆转录缓冲液 5μl 供试品（或不同灵敏度标准逆转录 酶或阳性对照、阴性对照） 2μl 2. 5mmol/ml脱氧核糖核苷酸（dNTPs） 0.5μl 25mmol/ml氯化镁 0.5μl 二硫苏糖醇（DTT） 0.5μl DEPC处理的水15.1μl至总量为23.6μl。 4. PCR扩增体系 PCR缓冲液 10μl 2.5mmol/ml dNTPs 2μl 10pmol/μl引物RT-1 2μl 10pmol/μl引物RT-2 3μl RNA酶H 1μl DEPC处理的水至75μl 加入Taq DNA聚合酶0.2μl。 5. 甲基氨基甲烷-硼酸（TBE）电泳缓冲液 甲基氨基甲烷 54g 硼酸 27.5g 加入0.5mol/L四甲基乙二胺（pH8.0）20ml定容至1000ml，使用时1:5倍稀释。 供试品、灵敏度标准及阳性对照品的制备 1. 按标示量复溶供试品。 2. 取1U逆转录酶用DEPC处理的水做10倍系列稀释，取10-6、10-7和10-8稀释度各2μl作为灵敏度标准。 3. 阳性对照：用SP2/0细胞培养上清液作为阳性对照。 4. 阴性对照：用2μl DEPC处理的水代替。 检查法 1. 逆转录 1.1 将模板引物基本反应体系1.4μl依次置于95℃反应5分钟，37℃反应30分钟，4℃反应5分钟后，加入逆转录反应体系23.6μl（总体积为25μl），置37℃作用30分钟。 1.2 分别将供试品、阳性对照、阴性对照及稀释度为10-6~10-8灵敏度标准的逆转录酶2μl加入上述逆转录反应体系，分别置37℃作用30分钟。 2. PCR扩增 取PCR扩增体系75μl，加入上述经各逆转录后的样品，混匀后，按下列条件进行扩增：94℃30秒，55℃100秒，72℃110秒，共35个循环周期，72℃延伸10分钟。产物作琼脂糖凝胶电泳分析，如不能立即进行琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物应于2~8℃保存。 3. PCR扩增产物的电泳 将适量的PCR扩增产物加到2%琼脂糖凝胶板上进行电泳分析（通则0541第三法），同时加DNA分子量标准，电泳后紫外灯下观察DNA条带结果。 结果判定 阳性对照于112bp处呈现条带，阴性对照不出现任何条带，供试品于112bp处呈现条带判为阳性。 【附注】 逆转录酶灵敏度标准应大于等于10-7。 |
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