本品系用卡介菌经培养、杀菌、过滤除去菌体后纯化制成的纯蛋白衍生物，用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后机体免疫反应的监测。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD）生产车间必须与其他非卡介菌生物制品生产车间及实验室分开。原液生产全部过程，包括卡介菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行，所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。从事BCG-PPD生产的工作人员必须身体健康，经X射线检查无结核病，且每年经X射线检查1～2次，可疑者应暂离该制品的制造。 2 制造 2.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.1 名称及来源 采用卡介菌D2PB 302菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 2.1.3 种子批的传代 自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。 2.1.4 种子批的检定 2.1.4.1 染色镜检 应为短粗杆菌，微弯曲两端圆，抗酸染色阳性。 2.1.4.2 培养特性 于37～39℃培养时，在苏通马铃薯培养基发育成干皱成团略呈浅黄色的菌苔。在牛胆汁马铃薯琼脂培养基为浅灰色黏膏状菌苔。在苏通培养基卡介菌应浮于表面，为多皱、微黄色的菌膜。 2.1.4.3 毒力试验 用TB-PPD皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性的、体重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，4～5周后解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的结核病变。 2.1.4.4 无有毒分枝杆菌试验 用TB-PPD皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性的、体重为300～400g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射lml菌液（10mg/ml），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只豚鼠，满3个月时解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量0.85%～0.90%氯化钠溶液混匀后，皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行；若证实系结核病变，该菌种即应废弃。若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上时应复试。 2.1.5 种子批的保存 冻干菌种保存于8℃以下，液体菌种保存于-70℃以下。 2.2 原液 2.2.1 生产用种子 启开工作种子批菌种，在L-J培养基、苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基每传1次为1代。在马铃薯培养基培养的菌种置冰箱保存，不得超过2个月。 2.2.2 培养基 工作种子批菌种首次复苏可用L-J培养基，生产用培养基采用苏通马铃薯培养基、改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基。 2.2.3 接种和培养 挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他培养基的表面，于37～39℃静置培养8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，应废弃。 2.2.4 收获及杀菌 培养终止，将培养物于121℃、30分钟杀菌，过滤除去菌膜及菌体。如滤液需保存，应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的抑菌剂，于4～8℃保存，保存期不超过30天。 2.2.5 纯化 收集滤液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，或采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。 2.2.6 合并与分装及冻干 2.2.6.1 合并 同批分次纯化的原液可以合并，但不得超过5次。 2.2.6.2 分装及冻干 原液检定合格后，可根据蛋白质含量，将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即冻干。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.2.8 保存及有效期 原液应于2～8℃保存。液体原液自效价测定合格之日起，有效期为5年；原液冻干品自效价测定合格之日起，每隔5年应按3.1项进行检定，合格后可继续使用。 2.3 半成品 2.3.1 配制 经检定合格的原液，用0.01mol/LPBS（pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀释至50IU/ml。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量为0.1ml，含BCG-PPD 5IU。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 外观 原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。 3.1.2 复溶时间 冻干品按标示量加入注射用水后，应于3分钟内完全溶解。 3.1.3 水分 冻干品水分应不高于3.0%（通则0832）。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.4.2 多糖与核酸含量 每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。 （1）多糖含量测定 以0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100μg/ml葡萄糖标准品溶液。取硫酸225ml加入75ml 0.85%～0.90%氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度葡萄糖标准品溶液及本品，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，置沸水浴20分钟后在波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准品溶液浓度对应其吸光度，用Minitab或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。 3.1.5 效价测定 3.1.5.1 动物法 将标准品及本品分别稀释3个不同的适宜稀释度，至少取4只已经卡介菌致敏的、体重为400～600g的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度本品各0.1ml或0.2ml，于注射后24小时、48小时各观察局部硬结的纵径与横径（可根据48小时的反应结果判定），计算每个稀释度2天的硬结反应总和或平均面积，并求其比值，每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为0.8～1.2，如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求。 3.1.5.2 稀释度选择 稀释度的选择应能使本品注射后24小时所产生的局部硬结反应直径为8～25mm；本品和标准品的反应直径大小应相似，且本品和标准品的3个稀释度的剂量对数反应曲线应基本平行。若本品效价与标准品效价不一致，可用同样方法复试1次，并算出相当于标准品的效价，进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至符合要求。 3.1.6 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.7 无分枝杆菌试验 量取1.0ml本品，分别接种于10支罗氏鸡蛋培养基，于37℃培养4周，应无分枝杆菌生长。 3.1.8 致敏效应试验 试验组与对照组分别选用体重300～400g未做过任何试验的豚鼠各3只，试验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含500IU的本品，共3次，每次间隔5天。在第3次注射后15天，试验组与对照组豚鼠各皮内注射0.lml含500IU的本品，连续观察3天，两组动物反应应无明显区别。 3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 取经卡介菌致敏的豚鼠至少4只，皮内注射0.2ml本品，24小时后豚鼠的平均硬结反应直径（纵、横直径相加除以2）均应不小于5mm。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为无色澄明液体，无不溶物或异物。 3.3.2.2 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 pH值 应为6.8～7.4（通则0631）。 3.3.3.2 苯酚含量 应不高于3.0g/L（通则3113）。 3.3.4 效价测定 取经卡介菌致敏的、体重为400～600g豚鼠，皮内注射0.2ml标准品与本品，至少各4只，注射后24小时、48小时各观察结果1次（可根据48小时的反应结果判定），计算本品和BCG-PPD标准品的平均硬结反应直径，计算累计值，并求其比值，应为0.8～1.2。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.6 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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