本法适用于禽源性生物制品的检测，包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗种子批毒种的外源性禽病毒检测。本法用提取的供试品RNA逆转录成cDNA后，或用提取的供试品DNA，针对3种外源性禽病毒设计特异性引物探针，进行荧光定量PCR检测特异性扩增信号，从而测定供试品中外源性禽源病毒核酸序列，以检查供试品的外源性禽病毒污染。 要求检测的3种禽源性病毒： (1)外源性禽腺病毒I型(DNA病毒)； (2)外源性禽腺病毒Ⅲ型(DNA病毒)； (3)外源性禽白血病病毒(逆转录病毒)。 试剂 (1)RNA/DNA提取试剂 RNA/DNA的提取可使用酚-氯仿(三氯甲烷)法、磁珠法、离心柱法等。提取试剂中应含裂解液、洗涤液、洗脱液等，按试剂说明书要求配制。 (2)逆转录试剂含逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP混合液、随机引物、逆转录反应缓冲液等，按试剂说明书要求配制。 (3)引物序列、探针序列见下表。 (4)扩增缓冲液 每20μl反应体系中，含有上、下游引物各5pmol，探针2.5pmol及适量荧光定量PCR混合液(Mix)。 (5)质粒标准品稀释液 为DNA稀释缓冲液或经无RNA酶水所稀释。 (6)对照溶液 以失活后无感染性的禽源性病毒为阳性对照。以无RNA酶水作为阴性对照。提取核酸和逆转录步骤同'(1)RNA/DNA提取试剂”，置﹣70℃保存备用。 (7)质粒标准品溶液及灵敏度对照的制备 选择病毒目的核酸序列，人工合成DNA，目的序列转入pMD 19-T质粒中，作为质粒标准品。测定质粒标准品的DNA核酸浓度后，对其进行10倍的倍比稀释，从109Copies/μl稀释至(7)100Copies/μl。 取107~103Copies/μl质粒标准品溶液作标准曲线各点。101Copies/μl稀释度作为灵敏度对照。置冰浴备用。 供试品制备 供试品用于核酸提取的模板量不少于0.2ml。 检查法 （1）核酸提取及逆转录取供试品和阴性、阳性对照，各3个重复，按照DNA/RNA试剂盒的使用说明书提取DNA/RNA。 按照逆转录试剂盒的使用说明书将RNA逆转录为cDNA。 （2）荧光定量PCR扩增 取DNA或cDNA 5μl加至实时荧光定量PCR扩增缓冲液15μl中，反应总体积为20μl。各3个重复，混匀后，按下列条件进行扩增：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 15秒；60℃ 1分钟......共40个循环。在60℃釆集信号。 结果判定 (1)灵敏度检查 分别检测101Copies/μl和100Copies/μl供试品，各10个重复。至少101Copies/μl灵敏度对照应全部检出(10/10)，则灵敏度检查合格。 (2)试验有效性 标准曲线相关系数(R2）应不低于0.990，阳性对照应为阳性，Ct值应≤32，并呈明显的扩增曲线；灵敏度对照应为阳性，Ct值应≤35；阴性对照应为阴性，Ct值＞35，无明显的扩增曲线；则试验有效。 (3)供试品结果判定 如果供试品的Ct值≤35，同时拷贝数≥10，且有明显的扩增曲线，则判定供试品外源性禽病毒为阳性。否则为阴性。供试品结果出现阳性时，需使用血清学方法仲裁。 注意事项 (1)质粒标准品稀释时，用新吸头吸取上一个稀释度样本加至下一个稀释管中，涡旋混匀；然后用新吸头进行下一个稀释。 (2)试验中所有吸头均需无菌，与供试品有关的操作建议使用带滤芯吸头。 (3)注意实验分区，定期对各区进行消毒。 |
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