本法系依据在四硼酸钠存在的条件下,己二酰肼(ADH)中的氨基基团能与三硝基苯磺酸(TNBS)发生显色反应,采用紫外-可见分光光度法(通则0401)测定b型流感嗜血杆菌多糖衍生物中己二酰肼的含量。 试剂 (1)己二酰肼对照品贮备液(lmg/ml)精密称定己二酰肼0.100g,加水定容至100ml,于-20℃保存。 (2)己二酰肼对照品工作液(20μg/ml)精密量取己二酰肼对照品贮备液0.2ml,加水定容至10ml。 (3)5%四硼酸钠溶液 称取四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)47.35g,加水定容至500ml,于室温保存。 (4)3%TNBS溶液 配制3%的TNBS溶液,于-20℃保存。 测定法 量取5%四硼酸钠溶液1.0ml,加水1ml,混匀,再加入3%TNBS溶液0.3ml,混匀,于室温放置15分钟,在波长500nm处测定吸光度,作为空白对照。 先将供试品用水稀释至己二酰肼浓度不高于20μg/ml,作为供试品溶液,然后取1.0ml,加入5%四硼酸钠溶液1.0ml,自本法前述“加入3%TNBS溶液0.3ml”起,同法操作。 分别取己二酰肼对照品工作液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于试管中,每管依次加水0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0.0ml,加入5%四硼酸钠溶液1.0ml,自本法前述“加入3%TNBS溶液0.3ml”起,同法操作。 结果计算 以己二酰肼对照品工作液的浓度对其相应的吸光度作直线回归,求得直线回归方程,将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程,求出供试品溶液的己二酰肼含量,根据稀释倍数计算供试品的己二酰肼含量。 |