本品系由含有高效表达抗人表皮生长因子受体单克隆抗体基因的小鼠骨髓瘤（NS0）细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后获得的重组人表皮生长因子受体单克隆抗体制成。不含抑菌剂和抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程细胞 2.1.1 名称及来源 尼妥珠单抗的工程细胞系由编码尼妥珠单抗重链的pSV2-gpt质粒和编码轻链的pSV-hyg质粒转入NS0宿主细胞构建而成。 2.1.2 细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞经无血清培养液驯化，细胞传代、扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代、扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 2.1.3.1 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 2.1.3.2 抗体表达量测定 细胞库的抗体表达量应不低于5μg/ml。 2.2 原液 2.2.1 细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。 2.2.2 生产用细胞培养液 生产用细胞培养液应不含任何血清与抗生素。 2.2.3 细胞培养 采用经批准工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即“收获液”。细胞培养全过程应严格按照无菌操作。 2.2.4 分离纯化 收获液按经批准的工艺进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的尼妥珠单抗，即为尼妥珠单抗原液。除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按批准的工艺将原液用缓冲液稀释，除菌过滤后即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 2.4.3 规格 50mg（10ml）/瓶 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 鉴别试验 3.1.1.1 等电点 依法测定（通则0541第六法），应符合规定。 3.1.1.2 肽图 依法测定（通则3405）。供试品经变性、还原和烷基化，按1∶50（mg/mg）加入测序级胰蛋白酶（酶切缓冲液：50mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1mmol/L氯化钙，1mol/L尿素，pH8.1），37℃±0.5℃保温16小时，加入0.1%三氟乙酸终止酶切。上样前每分钟16000转离心15分钟，取上清液作为供试品溶液。色谱柱以四烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：Vydac C4 柱，25cm×4.6mm，粒度5μm或其他适宜的色谱柱），柱温为35℃±0.5℃；流速为每分钟0.8ml；检测波长为214nm，取供试品溶液20μl注入液相色谱仪；按下表进行梯度洗脱（表中流动相A为0.1%三氟乙酸，流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈水溶液）。对照品同法操作。 供试品肽图应与尼妥珠单抗对照品一致。 3.1.1.3 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N端序列应为: 轻链：Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val。 重链：（p）Gln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys-Pro-Gly。 3.1.2 pH值 应为6.5～7.5（通则0631）。 3.1.3 纯度和杂质 3.1.3.1 高效液相色谱法 （1）分子排阻色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子量为10～500kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂（如：TSK-3000SW凝胶色谱柱或其他适宜的色谱柱）；流动相为0.1mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L氯化钠-0.01%叠氮钠缓冲液，pH6.7；检测波长为280nm。用流动相将供试品稀释至每1ml中约含4mg，作为供试品溶液，取供试品溶液25μl注入液相色谱仪。按面积归一化法计算，免疫球蛋白单体含量应不低于95.0%。 （2）弱阳离子色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱为弱阳离子交换柱（如：ProPac WCX-10，4mm×25cm或其他适宜的色谱柱）；以A（精密量取200mmol/L磷酸氢二钠61.0ml、200mmol/L磷酸二氢钠39.0ml，加水至2000ml，充分混匀）、B（精密量取200mmol/L磷酸氢二钠61.0ml、200mmol/L磷酸二氢钠39.0ml、1mol/L氯化钠1000ml，加水900ml，充分混匀）为流动相，检测波长为280nm。用流动相A将供试品和对照品分别稀释至每1ml中约含0.5mg，作为供试品溶液和对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各60μl，分别注入液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱。 供试品图谱应与对照品的一致。 3.1.3.2 毛细管凝胶电泳法（CE-SDS） （1）CE-SDS还原电泳 依法测定（通则3127），免疫球蛋白重链和轻链含量应不低于90.0%，非糖基化重链不得高于5.0%。 （2）CE-SDS非还原电泳 依法测定（通则3127），免疫球蛋白单体不得低于92.0%。 3.1.3.3 蛋白质A残留量 用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，蛋白质A残留量应不高于蛋白质总量的0.001%。 3.1.3.4 外源性DNA残留量 每1支/瓶应不高于100pg（通则3407）。 3.1.3.5 宿主细胞蛋白质残留量 用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，应不高于蛋白质总量的0.01%。 3.1.4 相对结合活性 依法测定（通则3531），相对结合活性应为标准品的80%～150%。 3.1.5 蛋白质含量 3.1.6 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1mg应小于1EU。 3.2 半成品检定 3.2.1 pH值 应为6.5～7.5（通则0631）。 3.2.2 蛋白质含量 照3.1.5项下的方法测定，应为4.6～5.5mg/ml。 3.2.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.4 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1mg应小于1EU。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 3.3.1.1 等电点 依法测定（通则0541第六法）。供试品的等电点图谱应与对照品的一致。 3.3.1.2 相对结合活性 依法测定（通则3531），应符合规定。 3.3.2 理化检定 3.3.2.1 外观 应为无色澄明液体，可带轻微乳光。 3.3.2.2 溶液的澄清度 取本品，溶液应澄清。如显浑浊，与2号浊度标准液（通则0902）比较，不得更浓。 3.3.2.3 可见异物 依法检查（通则0904），应符合规定。 3.3.2.4 不溶性微粒 依法检查（通则0903），应符合规定。 3.3.2.5 装量 依法测定（通则0102），应不低于标示量。 3.3.2.6 pH值 应为6.5～7.5（通则0631）。 3.3.2.7 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应为240～360mOsmol/kg。 3.3.3 纯度和杂质 3.3.3.1 高效液相色谱法 照3.1.3.1项进行。 3.3.3.2 毛细管凝胶电泳法（CE-SDS） 照3.1.3.2项进行。 3.3.3.3 聚山梨酯80含量 依法检查（通则0512），应为0.1～0.3mg/ml。 3.3.4 效价 3.3.4.1 生物学活性鉴别 依法测定（通则3531），应符合规定。 3.3.4.2 相对结合活性 依法测定（通则3531），相对结合活性应为标准品的60%～140%。 3.3.5 蛋白质含量 照3.1.5项进行，应为4.6～5.5mg/ml。 3.3.6 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.7 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1mg应小于1EU。 3.3.8 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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