本品系由高效表达人干扰素α2b基因的腐生型假单胞菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的人干扰素α2b，加入软膏基质制成。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的腐生型假单胞菌菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种LB琼脂平板 应呈典型腐生型假单胞菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 应呈棒状，可运动，有荚膜，无芽抱。涂片染色后应呈典型的革兰氏阴性。 2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。 2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型腐生型假单胞菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5 生化反应 不液化明胶，不水解淀粉和聚羟基丁酸酯（通则3605），不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。 2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7 表达的干扰素型别 应用抗α2b型干扰素血清做中和试验，证明型别无误。 2.1.3.8 质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。 2.1.3.9 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。 2.2.4 发酵液处理 用高速离心法收集、处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存，保存时间应不超过1年。 2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为人干扰素α2b原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.3 软膏剂制备 采用的基质应符合软膏剂基质要求（通则0109）。 2.3.1 配制 按经批准的配方进行配制。 2.3.2 软膏制备 按经批准的工艺进行。软膏质地应均匀、细腻，涂展性良好，排除气泡。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 规格 25万IU/5g/支；50万IU/10g/支 2.4.3 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0109有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（通则3523）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IUo 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测。以干扰素色谱峰计算的理论板数应不低于1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 相关蛋白 依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：C18柱，4.6mm×25cm，粒径5μm或其他适宜的色谱柱），柱温为室温；以0.2%三氟乙酸-30%乙腈的水溶液为流动相A，以0.2%三氟乙酸-80%乙腈的水溶液为流动相B；流速为1.0ml/min；在波长210nm处检测；按下表进行梯度洗脱。 用超纯水将供试品稀释至每lml中约含1.0mg，作为供试品溶液；取供试品溶液和过氧化氢溶液混合，使过氧化氢终浓度为0.005%（m/m），室温放置1小时或1小时以上，使得干扰素约5%发生氧化，再向每毫升该溶液中加入L-甲硫氨酸12.5mg，作为对照品溶液（2～8℃放置不超过24小时）。取供试品溶液和对照品溶液各50μ1注入液相色谱仪。 对照品溶液及供试品溶液图谱中，干扰素主峰的保留时间约为20分钟。对照品溶液图谱中，氧化型峰相对于主峰的保留时间约为0.9，氧化型峰与主峰的分离度应不小于1.0。 按面积归一化法只计算相对于主峰保留时间为0.7～1.4的相关蛋白峰面积，单个相关蛋白峰面积应不大于总面积的3.0%，所有相关蛋白峰面积应不大于总面积的5.0%。 3.1.6 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为19.2kD±1.9kD。 3.1.7 外源性DNA残留量 每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。 3.1.8 宿主菌蛋白质残留量 应不高于蛋白质总量的0.02%（通则3413）。 3.1.9 残余抗生素活性 依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.1.10 等电点 主区带应为5.7～6.7，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。 3.1.11 紫外光谱 用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为278nm±3nm（通则0401）。 3.1.12 肽图 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。 3.2 成品检定 除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。 3.2.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.2.2 物理检查 3.2.2.1 外观 应为无色半透明膏体。 3.2.2.2 装量 依法检查（通则0109），应符合规定。 3.2.3 化学检定 pH值应为5.0～6.5（通则0631）。 3.2.4 生物学活性 应为标示量的80%～150%（通则3523）。 3.2.5 微生物限度检查 依法检查（通则1105、通则1106与通则1107），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存及运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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