本法系依据在碱性条件下,羟胺与碘反应生成亚硝酸,然后与对氨基苯磺酸发生重氮化反应,再与α-萘胺耦联形成有色的偶氮化合物,采用紫外-可见分光光度法(通则0401)测定羟胺的含量。 试剂 (1) 6%乙酸钠溶液 称取无水乙酸钠6g,加适量水溶解并稀释至100ml混匀即得。 (2)1%对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸0.50g,加适量25%乙酸溶液溶解后稀释至50ml,即得。 (3)1.3%碘溶液 称取碘0.65g;溶于冰醋酸,稀释至50ml,即得。于通风橱中配制和使用。 (4)0.4mol/L硫代硫酸钠溶液 称取硫代硫酸钠3.16g,溶于适量水中,稀释至50ml,即得。 (5)0.6% α-萘胺溶液 称取α-荼胺0.3g,溶于30%乙酸,稀释至50ml,即得。于通风橱中配制和使用。 盐酸羟胺对照品溶液的制备 用水将盐酸羟胺对照品定量稀释至每lml含1000nmol,作为贮备液。精密量取贮备液适量,用水定量稀释至每1ml含150nmol、120nmol、90nmol、60nmol和30nmol,作为不同浓度的对照品溶液,用前配制。 测定法 精密量取供试品0.3ml置试管内,依次加6%乙酸钠溶液1.3ml、1%对氨基苯磺酸溶液0.2ml及1.3%碘液0.1ml,混匀,放置10分钟,加0.4mol/L硫代硫酸钠溶液50μl,混匀脱色,加0.6%a-萘胺溶液40μl,混匀,室温放置60分钟,经每分钟10000转离心5分钟后,取上清液,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在波长520nm处测定吸光度。精密量取不同浓度的对照品溶液各0.3ml,置试管中,自本段前述“依次加6%乙酸钠溶液1.3ml”起,同法操作。精密量取水0.3ml置试管中,自本段前述“依次加6%乙酸钠溶液1.3ml”起,同法操作,作为空白对照。以对照品溶液的羟胺浓度对相应吸光度作直线回归,求得直线回归方程;将测得的供试品的吸光度代入直线回归方程,即得供试品的残留羟胺浓度(nmol/ml),再根据供试品的蛋白质含量按下式计算出羟胺残留量(nmol/mg蛋白质)。 |