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青霉素酶及其活力测定法

    药品名称: 1202 青霉素酶及其活力测定法
    版本: 2020年版
    来源: 四部
    分类: 通则
    内容:

    培养基

    胨 15g 0.1%硫酸亚铁(FeSO4?7H2O)溶液 0.5ml

    氯化钠 4g

    枸椽酸钠 5.88g 20%硫酸镁(MgSO4?7H2O)溶液 1ml

    磷酸氢二钾 4g

    甘油 50g 肉浸液 1000ml

    混合上述成分,调节pH值使灭菌后为7.0~7.2,分装于500ml锥形瓶内,每瓶80ml,在115℃灭菌30分钟。

    青霉素酶溶液的制备

    取蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)〔CMCC(B)63 301〕的斜面培养物,接种至上述一瓶培养基内,在25℃摇床培养18小时后,取此培养物接种至其余各瓶培养基内,每瓶接种10ml,同时每瓶加入无菌青霉素4500单位,在25℃摇床培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,再加无菌青霉素2万单位,继续培养24小时,离心沉淀菌体,调节pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌,滤液用无菌操作调pH值至近中性后,分装于适宜容器内,在10℃以下贮存,备用:

    酶活力测定

    青霉素溶液的制备 称取青霉素钠(钾)适量,用磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。

    青霉素酶稀释液的制备 取青霉素酶溶液,按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释成每1ml中约含青霉素酶8000~12 000单位的溶液,在37℃预热。

    测定法 精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中,预热至37℃后,精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml,迅速混匀,在37℃准确放置1小时,精密量取3ml,立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/L)[精密量取碘滴定液(0.05mol/L)10ml,置100ml量瓶中,用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度]25ml中,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定,至近终点时,加淀粉指示液,继续滴定至蓝色消失。

    空白试验 取已预热的青霉素溶液2ml,在37℃放置1小时,精密加入上述碘滴定液(0.005mol/L)25ml,然后精密加青霉素酶稀释液1ml,在室温暗处放置15分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式计算:

    E=(B-A)×M×F×D×100

    式中 E为青霉素酶活力,单位/(ml?h);

    B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

    A 为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量,ml;

    M 为硫代硫酸钠滴定液的浓度,mol/L;

    F 为在相同条件下,每1ml的上述碘滴定液(0.005mol/L)相当于青霉素的效价,单位;

    D 为青霉素酶溶液的稀释倍数。

    【附注】磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水使成l000mL

    醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml,两液混合均匀。

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