1 概述 聚乙二醇(polyethylene，PEG)是一类由环氧乙烷聚合而成的化合物，具有一定分子量分布与亲水性特点，呈线性、分支型及其他特殊类型的分子形态。人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品是通过聚乙二醇端基的活性基团与重组蛋白或多肽的氨基酸侧链基团、N端/C端的氨基或羧基发生共价反应，修饰而成的治疗性药物。 本总论规定了人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品生产和质量控制的通用性技术要求，重点针对聚乙二醇修饰的重组蛋白产品。涉及重组蛋白的生产及质量控制，还应符合 “人用重组DNA蛋白制品总论” 及本版药典相关各论的具体要求。 2 制造 2.1 基本要求 人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品具有复杂的质量属性，应在充分了解临床应用目的的基础上确定制品的关键质量属性，以“质量源于设计”“风险评估”的原则和理念，确定相应的修饰策略、生产工艺、质量控制策略，并通过建立有效的“质量管理体系”保证制品的安全性和有效性。人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的制造主要包括重组蛋白和多肽的制备、聚乙二醇修饰、修饰产物的分离和纯化及制剂等过程。 生产过程中使用的原材料和辅料应符合本版药典的相关要求。制备重组原型蛋白和多肽所需的工程细胞的来源、管理及检定应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。生产质量管理应符合中国现行《药品生产质量管理规范》的要求。 2.2 聚乙二醇 应选用适宜的聚乙二醇进行修饰，并明确聚乙二醇的活性基团种类、拟成键的键型、分子形态、分子量范围等质量属性，以确保批间一致性。 2.2.1 分子量及多分散性 可采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、凝胶渗透色谱-多角度激光散射(GPC-MALLS)检测器或凝胶渗透色谱-示差检测器(GPC-RID)等方法测定聚乙二醇的重均/数均分子量及多分散性。 2.2.2 端基取代率 聚乙二醇的分子末端需经活性基团取代后方可与蛋白质和多肽上的反应基团发生修饰，可采用核磁共振(NMR)或液相色谱柱前衍生法进行测定。 2.2.3 杂质检测 应对聚乙二醇中可能存在的双醇、断裂与非活化聚乙二醇等特定杂质及其他需要控制的相关杂质进行分析及限量控制。 2.3 重组原型蛋白及多肽 应按照“人用重组DNA蛋白制品总论”和相关各论的要求，对重组原型蛋白的理化特性、生物学活性、免疫化学特性等质量属性以及工艺与产品相关杂质进行控制。应尽可能明确重组原型蛋白和多肽的活性中心、配体或底物结合中心所涉及的氨基酸，抗原表位的结构特点与关键氨基酸序列，以及可能发生修饰的氨基酸在重组原型蛋白表面的分布情况。 2.4 生产过程的控制 2.4.1 重组原型蛋白的制备 应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”和相关各论的要求。 2.4.2 聚乙二醇修饰及偶联工艺 聚乙二醇修饰方式包括定点修饰、单位点随机修饰或多位点随机修饰等方式。修饰及偶联工艺的选择应设定适宜的反应条件，以降低重组原型蛋白和多肽药物的活性损失及可能的修饰副产物。应设定关键工艺参数的可接受限值范围，包括聚乙二醇的加入方式、聚乙二醇与蛋白质或多肽的投料比、缓冲液的组成及酸碱度、反应条件等。应建立适宜的工艺过程控制，以保证偶联反应的批间一致性。 2.4.3 修饰蛋白的提取和纯化 根据修饰产物的理化特性确定分离、纯化和反应条件。如可依据修饰产物电荷的变化或分子量的变化选择相应的分离纯化手段，工艺参数建立的目标为尽可能获得组分一致的修饰产物。 2.4.4 修饰蛋白原液 纯化后的修饰产物分装于贮存容器中即为原液。如需加入稳定剂或赋形剂，应不影响质量检定，否则应在添加辅料前取样进行原液检定。应采用适宜方法对原液质量进行检测，必要时应与参比品进行比较。原液的含量测定方法与成品制剂的含量测定方法显著不同时，应考虑方法之间的测定误差，避免因此引发的原液投料偏差。 2.4.5 半成品 除另有规定外，如需对原液进行稀释或加入其他辅料制成半成品，应在制备成品前确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受的标准。 2.4.6 成品 应符合本版药典相关通则的要求。 3 质量控制 人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的质量控制与修饰蛋白和多肽的分子大小、修饰位点与修饰程度、结构特征、质量属性复杂程度以及生产工艺相关。质量控制体系主要包括原辅材料的质量控制、生产工艺的过程控制以及产品检定等。质量控制策略应基于对关键原料的质量评价、对终产品关键质量属性的理解和积累，结合风险评估手段而综合制定。纳入质量标准的检定项目、可接受标准限度，应结合来自代表工艺的多批样品的数据、用于证明生产批次间一致性的数据、临床末期工艺放大后的验证数据、稳定性研究数据等综合确定。 3.1 特性分析 采用适宜的、先进的分析技术手段，从理化（分子大小与分子量分布、等电点、氨基酸组成、修饰情况、空间构象等）、免疫学、生物学特性，有关物质和杂质等方面对修饰产物进行严格的特性分析，作为原液及制品质量标准建立的基础，以保证制品具有预期的构象、聚集和（或）降解状态。特性分析至少应包括以下方面。 3.1.1 理化特性 3.1.1.1 修饰位点 对于单位点和多位点随机修饰产物，应确定主要丰度的修饰位点和比例，并说明主要修饰位点是否位于活性中心内。必要时，应明确次要修饰位点及其含量，以保证工艺稳定和批间一致性。对于定点修饰的修饰产物，应确证目标修饰位点并规定其所占比例的限度要求。修饰位点的确定可通过直接比较修饰前后蛋白质的质量肽图，也可采用适宜的色谱分离手段分离修饰物或异构体，再对其进行质量肽图比对或氨基酸测序、质谱分析、实时成像毛细管等电聚焦电泳（cIEF-WCID）分析等。 3.1.1.2 平均修饰率 平均修饰率反映修饰效果，是指重组原型蛋白或多肽中已发生修饰的基团占全部可被修饰基团的百分比例，可通过准确测定修饰产物中聚乙二醇与蛋白质的含量，并经分子量换算摩尔比得到。可采用TNBS法/荧光胺法、液相色谱-多种检测器联用法、水解法等进行测定。 3.1.1.3 位点异构体 聚乙二醇随机修饰的蛋白质，通常发生在赖氨酸侧链以及N端α-氨基，可导致修饰产物的等电点发生改变。可采用离子交换色谱法等适宜方法对单位点随机修饰产物的位点异构体进行分离并尽可能给出不同异构体的占比限度要求；应尽可能明确多位点随机修饰产物的位点异构体。 3.1.1.4 聚乙二醇修饰数目的范围及相对含量 对于多位点随机修饰产物，应建立聚乙二醇修饰数目的控制方法，说明修饰数目的分布情况。可采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、分子排阻色谱（SEC）、离子交换色谱、变性SDS-PAGE法或其他适宜方法，对修饰数目的范围及其相对含量进行控制。 3.1.1.5 分子量 分子量是聚乙二醇对重组原型蛋白是否正确修饰的标识，可采用MALDI-TOF-MS等方法测定制品的平均分子量。 3.1.1.6 等电点 修饰蛋白或多肽的等电点可能发生偏移，一定程度上可反映聚乙二醇的修饰程度。可采用水平薄板等电聚焦电泳、毛细管等电聚焦电泳或全柱成像毛细管等电聚焦电泳等方法确定修饰物的等电点范围。对于分子量较大的修饰产物，可采用琼脂糖为支持物的平板等电聚焦电泳，以避免空间位阻对迁移率的影响。 3.1.1.7 空间结构（高级结构）的一致性 可采用适宜的方法对修饰前后蛋白质和多肽的高级结构进行比较和分析，并评价一致性。 3.1.2 生物学活性 生物学活性应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”的要求。修饰蛋白及多肽与重组原型蛋白及多肽在结构、生物学活性上均可能存在显著不同，应根据产品特点，以及待测样品与标准品量-效反应关系的差异，选择适宜的修饰前/后生物学测定方法和活性参考品。 聚乙二醇化重组蛋白及多肽药物的体内生物学活性测定，可在重组原型蛋白体内生物效价的评价方法基础上，摸索修饰产物的血药浓度-时间曲线，建立新的测定方法，必要时可重新定义效价单位。 对于酶的活性测定，应对修饰后的酶类制剂重新测定其特征反应动力学参数，即kcat值（催化常数）、Km值（米氏常数）与Vmax（最大反应速率）。 必要时应设定亲和力和免疫反应性（包括与其他类似结构蛋白的交叉反应性）检测项目，以及对目标分子中与相应表位作用部分的生物学鉴别。 3.1.3 杂质分析 应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”“药品杂质分析指导原则”“分析方法验证指导原则”的相关要求。 3.1.3.1 高分子物质 应对修饰蛋白的聚合体，以及聚乙二醇自身高分子聚合物（diol-PEG）形成的高分子蛋白质进行控制。可采用体积排阻色谱法、反相色谱法或碘染色还原SDS-PAGE法进行高分子物质的检查，应考察方法的灵敏度，并制备含有高聚物的系统适用性样品或高分子对照品。 3.1.3.2 聚乙二醇和原型蛋白残留量 聚乙二醇和原型蛋白残留量的控制有助于保证修饰产物工艺的稳定性和产品的安全性，应根据临床研究使用的最大剂量合理设定聚乙二醇和原型蛋白残留量的限度值。可采用蒸发光检测器等通用型检测器对残留聚乙二醇进行定量或限度分析，或采用凝胶色谱/反相色谱对原型蛋白中残留物进行分析。建立方法时应考察方法的灵敏度。 3.1.4 蛋白质含量 应采用适宜的理化/免疫学方法及同质对照品，对修饰产物进行蛋白质含量测定。应排除聚乙二醇对Lowry法或考马斯亮蓝染色法等常规含量测定方法可能存在的干扰。 3.1.5 参比品 应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”的相关要求。原则上应采用同质参考品，如采用原型蛋白等替代参考品，应对其适用性进行充分验证。 3.2 制品检定 应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”的原则。 3.2.1 鉴别 根据制品特性，选择理化、生物/免疫学方法，对修饰产物进行鉴别试验。修饰位点研究中所建立的液相肽图部分，可用于原液的鉴别检查。应建立产品专属的反相液相肽图法，采用通则或原型蛋白相关各论的肽图方法，应进行方法适用性验证和实验条件优化，使得通过比较修饰前后的肽图，可直观分析发生主要修饰的肽段。 3.2.2 聚乙二醇修饰程度 应设置平均修饰率、位点异构体的相对含量、聚乙二醇修饰个数的范围及相对含量、修饰产物的分子量、等电点等检查项对聚乙二醇修饰程度予以控制，此部分检定项目可在原液阶段进行控制。 3.2.3 有关物质和杂质 应采用适宜的方法对供试品氧化产物、脱酰胺产物、游离聚乙二醇、原型蛋白及多肽或其他结构不完整的分子进行定量分析，并对宿主蛋白、DNA及其他工艺杂质如修饰试剂、催化剂、有机溶剂等残留物进行检测。 3.2.4 效价 效价测定是以制品生物学特性相关属性为基础的生物学活性定量分析，原则上效价测定方法应尽可能反映或模拟其作用机制。比活性（每1mg蛋白质具有的生物学活性单位）对证明制品的一致性具有重要的价值。 3.2.5 含量 采用适宜方法和参考品作为对照，测定原液和成品的含量。 3.2.6 安全性试验 涉及原液安全性的相关检测项目应根据原液制备可能引入的安全性风险而定，通常包括微生物限度、细菌内毒素检查等。成品的安全性检测应至少包括无菌、细菌内毒素、异常毒性检查等。 3.2.7 其他检测项目 应根据相关制品的特性和剂型而定。检测应包括但不限于外观（例如性状、颜色）、可见异物及不溶性微粒检查，pH值、渗透压摩尔浓度、装量、装量差异、稳定剂和水分测定等。 4 包装及密闭容器系统 应对原液和成品与包装材料的相容性进行检测和确认，尤其应关注聚乙二醇与包装材料（如预灌封注射器及丁基胶塞中硅油）之间的相互作用，考察制品的澄清度、有关物质和活性等稳定性指标，有助于控制由此带来的产品潜在的安全性和有效性风险。此外，应采用适宜的方法对容器完整性进行检测，防止容器泄漏导致产品无菌状态的破坏。 5 保存、运输及有效期 制品应符合“生物制品分包装及贮运管理”的规定，在适宜的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 6 标签 标签应符合“生物制品分包装及贮运管理”要求和国家相关规定，标示内容至少应包括： （1）每瓶或每1ml的活性单位（如必要）； （2）每瓶有效成分含量和（或）蛋白质含量； （3）每瓶标示体积； （4）冻干制剂复溶液体的名称、体积及复溶后的使用期限； （5）使用前进行适量稀释（如果需要）； （6）有效期。 |
医药数据
