本法系以供试品与特异性抗体结合后,抗体再与酶标抗体特异性结合,通过酶学反应的显色,对供试品的抗原特异性进行检查。 试剂 (1)TG缓冲液 精密称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g,加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。 (2)EBM缓冲液 量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml,加水稀释至200ml。4℃保存。 (3)TTBS缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.05g、氯化钠4.5g,吸取聚山梨酯80 0.55ml,加适量水溶解,用盐酸调pH值至7.5,加水稀释至500ml。4℃保存。 (4)底物缓冲液 称取3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)15mg,取甲醇5ml、30%过氧化氢15μl,溶于25mlTTBS缓冲液中。用前配制。 检查法 取硝酸纤维素膜,用EBM缓冲液浸泡15分钟,将供试品、阴性对照品(可用等量的人白蛋白)及阳性对照品点在膜上,上样量应大于10ng。室温干燥60分钟。取出硝酸纤维素膜,浸入封闭液(10%新生牛血清的TTBS缓冲液,或其他适宜的封闭液)封闭60分钟。弃去液体,加入TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量的供试品抗体(参考抗体使用说明书的稀释度稀释),室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗3次,每次8分钟。弃去液体,更换TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量的生物素标记的第二抗体,室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗3次,每次8分钟。弃去液体,更换TTBS缓冲液10ml,摇动加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液,室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次,再用TTBS缓冲液浸洗4次,每次8分钟。弃去液体,加入适量底物缓冲液置于室温避光条件下显色,显色程度适当时水洗终止反应。 结果判定 阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。 |