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人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法

    药品名称: 3123 人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法
    版本: 2020年版
    来源: 四部
    分类: 通则
    内容:

    本法系依据过量的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)在一定条件下和氨基酸形成稳定的衍生产物(柱前衍生),用高效液相色谱法测定衍生产物,根据衍生产物的含量计算人免疫球蛋白中甘氨酸含量。

    照高效液相色谱法(通则0512)测定。

    色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为基质的C18反相色谱柱,粒度4μm,内径3.9mm,柱长150mm;柱温37℃;以140mmol/L醋酸钠、17mmol/L三乙胺(pH5.65)、1μg/ml乙二胺四乙酸二钠为流动相A液,以100%乙腈为流动相B液,以纯水为流动相C液,流速为每分钟1.0ml,按下表进行梯度洗脱32分钟,检测波长为248nm。甘氨酸与相邻色谱峰之间分离度应大于1.5;拖尾因子(T)为0.95-1.40(甘氨酸和α-氨基丁酸峰);RSD应不大于2.0%(甘氨酸对照品峰面积测量值)。

    内标溶液的制备 精密称取α-氨基丁酸对照品0.4g,加超纯水定容至100ml。

    对照品溶液的制备 (1)精密称取甘氨酸对照品2.5g,加超纯水定容至l00ml。

    (2)精密量取(1)项溶液1.0ml,加1.5%磺基水杨酸9.0ml,混匀静置2小时以上,以每分钟3000转离心10分钟,留取上清液备用。

    (3)精密量取(2)项上清液0.4ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.6ml,分别置10ml量瓶中,用纯水定容。

    (4)精密量取(3)项溶液各0.lml,加纯水0.4ml与内标溶液0.02ml,混匀备用。

    (5)精密量取(4)项溶液各10μl 放入衍生管中,加硼酸缓冲液(pH8~10)70μl 涡旋混合,并加入20μl AQC衍生剂涡旋混合15秒,即为对照品溶液。

    供试品溶液的制备 (1)精密量取供试品溶液1.0ml,加1.5%磺基水杨酸9.0ml,混匀静置2小时以上,以每分钟3000转离心10分钟,留取上清液备用。

    (2)精密量取(1)项上清液1.0ml,置10ml量瓶中,用纯水定容。

    (3)精密量取(2)项溶液0.1ml,加0.4ml纯水与内标溶液0.02ml,混匀后,精密量取10μl 放入衍生管中,加70μl 硼酸缓冲液涡旋混合,并加入20μlAQC衍生剂涡旋混合15秒,即为供试品溶液。

    测定法 精密量取对照品溶液与供试品溶液,分别注入液相色谱仪,记录色谱图32分钟。进样量为10μl 。按内标法计算。

    【附注】(1)甘氨酸含量测定应采用柱前衍生及内标法,除本法要求外,衍生剂也可选用异硫氰酸苯酯、邻苯二甲醛;内标物也可选用正缬氨酸;C18反相色谱柱的粒度也可选用5μm或亚2μm。根据液相色谱系统、C18反相色谱柱规格、衍生剂及内标物的不同,可以调整相应的色谱条件。

    (2)直线回归相关系数应不低于0.999。

    (3)系统适用性中重复性可用其他适宜方法。

    (4)本法也适用于血液制品中组氨酸和精氨酸测定,仅对照品改为相应的组氨酸或精氨酸。

    (5)根据供试品的甘氨酸含量,对照品和供试品的取量可做适当调整。

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