[意见反馈]返回搜索首页环球医药招商网 > 医药数据 > 《中国药典》2020年版

 

细菌内毒素检查法

    药品名称: 1143 细菌内毒素检查法
    版本: 2020年版
    来源: 四部
    分类: 通则
    内容:

    本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

    细菌内毒素检查包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶限度试验结果为准。

    本试验操作过程应防止内毒素的污染。

    细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示,1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。

    细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制,并以细菌内毒素国际标准品标定其效价。用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价,干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

    细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

    细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准,其内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或小于0.005EU/ml(用于光度测定法),且对内毒素试验无干扰作用。

    鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂,可以与细菌内毒素发生凝集反应。除了内毒素,鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应,产生假阳性结果。如遇含有β-葡聚糖的样品,可使用去G因子鲎试剂或G因子反应抑制剂来排除鲎试剂与β-葡聚糖的反应。

    试验所用的器皿需经处理,以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法(250℃、至少30分钟)去除,也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器具,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等,应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。

    供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时,可调节被测溶液(或其稀释液)的pH值,一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0~8.0的范围内为宜,可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。所用溶剂、酸碱溶液及缓冲液应不含内毒素和干扰因子。

    内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定∶

    式中L为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示;

    K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(kg?h)表示,注射剂K=5EU/(kg?h),放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg?h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg?h);

    M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml/(kg?h)、mg/(kg?h)或U/(kg?h)表示,人均体重按60kg计算,人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时,按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量(M)。

    按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。

    确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数,在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD∶

    式中L为供试品的细菌内毒素限值;

    λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

    方法1 凝胶法

    凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

    鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

    根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。取不同浓度的内毒素标准溶液,分别与等体积(如0.1ml)的鲎试剂溶液混合,每一个内毒素浓度平行做4管;另外取2管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入37℃±1℃的恒温器中,保温60分钟±2分钟。

    将试管从恒温器中轻轻取出,缓缓倒转180°,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动,造成假阴性结果。

    当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)。

    式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度;

    n为每个浓度的平行管数。

    当λc在0.5~2λ(包括0.5λ和2λ)时,方可用于细菌内毒素检查,并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

    干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

    注:A为供试品溶液;B为干扰试验系列;C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D为阴性对照。

    只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性,并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时,试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时,认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试验。

    可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性,要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

    当进行新药的内毒素检查试验前,或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时,须进行干扰试验。

    当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

    检查法

    (1)凝胶限度试验

    按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数不超过MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

    注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照。

    结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。

    若溶液A的两个平行管均为阴性,判定供试品符合规定。若溶液A的两个平行管均为阳性,判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,判定供试品符合规定,否则判定供试品不符合规定。

    若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A结果岀现不符合规定时,可将供试品稀释至MVD重新实验,再对结果进行判断。

    (2)凝胶半定量试验

    本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

    注:A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释如1倍、2倍、4倍和8倍,最后的稀释倍数不得超过MVD。

    B为含2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。

    C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

    D为阴性对照。

    结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5~2λ,试验有效。

    系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度。如果检验的是经稀释的供试品,则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数,即得到每一系列内毒素浓度c。

    若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时,则判定供试品不符合规定。当供试品溶液的所有平行管均为阳性,可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

    方法2 光度测定法

    光度测定法分为浊度法和显色基质法。

    浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间,或是检测浊度增加速度的方法。

    显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理,分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间,或检测值增加速度的方法。

    光度测定试验需在特定的仪器中进行,温度一般为37℃±1℃。

    供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等,参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

    为保证浊度和显色试验的有效性,应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

    标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时,需进行标准曲线的可靠性试验。

    用标准内毒素制成溶液,制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10),最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法,每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照,当阴性对照的吸光度小于或透光率大于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间,将全部数据进行线性回归分析。

    根据线性回归分析,标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980,试验方为有效。否则须重新试验。

    干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。

    注:A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。

    B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的,且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

    C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的,用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

    D为阴性对照。

    按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs,再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。

    当内毒素的回收率在50%~200%,则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

    当内毒素的回收率不在指定的范围内,须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素,并重复干扰试验来验证处理的有效性。

    当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境等发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。

    检查法 按“光度测定法的干扰试验'中的操作步骤进行检测。

    使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。

    试验必须符合以下三个条件方为有效∶

    (1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求;

    (2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后,计算出的内毒素的回收率要在50%~200%的范围内;

    (3)阴性对照吸光度小于或透光率大于标准曲线最低点的检测值或反应时何大于标准曲线最低点的反应时间。

    结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后,小于规定的内毒素限值,判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值,判定供试品不符合规定。

    注:本检查法中,“管”的意思包括其他任何反应容器,如微孔板中的孔。

招商信息

其它药品推荐

相关资讯

    江西栎鑫生物科技有限公司:以诚立业 恩泽华夏
    皮肤一绝草本乳膏以蛇舌草狼毒地肤子苦参冰片蛇床子土槿皮七星剑黄柏百部白藓皮等及醋酸氯己定作为主要原料,对引起皮炎神经性皮炎过敏性皮炎日光性皮炎接触性皮炎)足癣(香港脚鹅掌风烂脚丫脚臭脚气手脚脱皮体股癣花斑癣汗斑牛皮癣龟头炎女阴瘙痒痔疮疥疮蚊虫叮咬痤疮水泡白色糠疹荨麻疹等感染的葡萄球菌念球菌霉菌真菌大肠杆菌有较强的抑制作用并能预防皮肤感染。皮肤一绝儿童乳膏专为儿童婴幼儿研制。采用金银花苦参薄荷脑野菊花艾草芦荟茶树精油黄柏等及醋酸氯已定制成。用于婴幼儿儿童湿疹汗疹皮疹奶疹皮炎红屁股皮肤瘙痒热痱皮痒蚊
    2017/8/21 16:04:06

    江西栎鑫生物科技有限公司:以诚立业 恩泽华夏

    处方药网售怎么还不放开?
    目前,在医药行业,各大医药企业以及医药电商都在焦急地等待处方药网售政策的开放。关于这个话题从去年相关意见出台后就一直是行业的热点关注对象,行业内企业都因此做出了非常大的变动,从线下经营转移到线上发展,或者是线上线下同时进行。年已过去三分之一了,处方药网售政策到底何时才能放开根据现今的局势发展来看,很多企业已经按耐不住了,对此中国医药物资协会常务副会长李文杰说出了这样的一句话“处方药网售是必然的事,今天没放开明天没放开,后天肯定放开了。”不得不说这句话听起来真的有些会让人吐血,但也确定的告诉我们对
    2015/4/28 9:33:59

    处方药网售怎么还不放开?

    医药流通企业成功的关键在于舍弃大而全的利润诱惑
    环球医药网医药流通企业作为第三方物流,其成功的关键在于精通进销存送的其中一个环节,舍弃大而全的利润诱惑,专心致志发展现代物流的四个现代化。我国医药商业的配送模式,无论规模大小,是国有还是民营,不管处方药配送还是普药大物流,无非就是进销存送四个环节。纵观国内外企业第三方物流的做法,但凡成功者都是只专攻一或者两点。其中,中国医药集团采用销存与送的配送方式。中国医药集团在公立医院的覆盖网络广泛,集中于精神类药品毒麻环球医药网药品疫苗血液制品生物制品的特许配送。在终端和现金为王的配送市场,中国医药集团占
    2012/5/31 14:18:31

    医药流通企业成功的关键在于舍弃大而全的利润诱惑

    天士力柴胡舒肝丸说明书
    本页面信息仅供参考,请以产品实际附带说明书为准。天士力柴胡舒肝丸说明书文字版暂无天士力柴胡舒肝丸说明书图片版天士力柴胡舒肝丸外包装天士力柴胡舒肝丸生产厂家简介天士力创建于年,是以全面国际化为引领,以大健康产业为主线,以生命医学产业为核心,以生命健康产业为协同的高科技企业集团,位列中国制造业企业强中国民营企业强中国战略性新兴产业领军企业强。核心企业天士力医药集团股份有限公司年在上海证券交易所上市。迈进新发展阶段,天士力着力构建大健康产业发展新格局。天士力控股集团作为大健康事业战略规划的统领者发展方
    2023/2/28 11:37:32

    天士力柴胡舒肝丸说明书

    8个坏习惯癌症找上门
    癌症的产生与生活方式有很大关系,所以要避免癌症也必须从调整生活方式开始,避免以下个因素会让你更健康。不注意休息研究表明,睡眠不足也会诱发癌症。休息有助于恢复体力,没有良好的作息习惯不利于身体恢复,还会导致免疫力下降,使疾病更容易发生。所以规律作息,避免过劳都能帮你对抗癌症。摄入过多高盐饮食高盐饮食不仅会诱发高血压等心血管疾病,还与胃癌的发病率密切相关,高盐食品还会损伤肾脏,加剧钙质流失,所以要想健康每日摄入盐的总量不应超过克。吸烟烟对人们最主要的危害就是致癌,吸烟以及被动吸烟者罹患肺癌喉癌食管癌
    2011/8/1 11:47:14

    8个坏习惯癌症找上门

    健康饮水提倡早喝蜂蜜晚喝水
    关于饮水养生,有人主张,早晨喝一杯淡盐水,晚上喝一杯蜂蜜水。但是《健康时报》登过《清晨喝盐水到底好不好》的文章说早晨喝淡盐水不值得提倡,因为可能导致血压高。有人提倡,清晨喝杯蜂蜜水,睡前喝杯凉开水。还有人提出“养生一日三杯水”,即清晨一杯蜂蜜水,午休以后喝杯淡茶水,睡前喝杯普通的白开水。那么,究竟哪种方法更好呢北京协和医院营养科副主任于康早上喝盐水是不提倡的,因为可能导致血压高。早晨可以喝凉白开,或者老人喝一杯蜂蜜水也是可以的。因此,对于李先生提出的三种说法,按照水蜜盐的功效和人体的生理需要,还
    2009/4/24 16:24:10

    健康饮水提倡早喝蜂蜜晚喝水

环球医药网成立于2003年,专业提供医药招商、医药代理、信息资讯、品牌展示、药品招商等多元化服务的中国医药招商网站平台
www.qgyyzs.net 版权所有 Copy Right 2003-2024 中华人民共和国增值电信业务经营许可证:浙B2-20090049
免责声明:环球医药网只起到信息平台作用,不为交易经过负任何责任,请双方谨慎交易,以确保您的权益。