聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，即DNA片段的特异性体外扩增过程，其特异性依赖于与目的DNA片段两端互补的寡核昔酸引物。PCR基本原理为双链DNA在高温下发生变性解链成为单链DNA，当温度降低后又可以复性成双链，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核昔三磷酸(dNTP)及相应缓冲液，完成特定DNA片段的体外扩增。 聚合酶链式反应法按原理和用途可分为常规PCR法、实时定量PCR法(quantItatIve real-tIme PCR，qPCR)等。常规PCR法系利用供试品中一段特征DNA片段设计引物进行PCR扩增，并通过比较供试品组和对照组PCR产物片段大小或数量进行结果判定的核酸检测方法，也可结合限制性内切酶酶切多态性技术(restrictIon fragmen tlength polymor-phism，RFLP)、片段分析或核酸测序技术对扩增产物进行测定，主要用于动、植物源性中药材和饮片，原材料，中间体，原料药与辅料等种属鉴定，也可用于其他药品质量控制中特征DNA片段的检定。 1.对仪器的一般要求 包括可对温度进行连续控制的聚合酶链式反应分析仪(polymerase chain reaction analyzer，简称PCR仪)、具有稳压直流电源电泳仪和平板电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外透射仪)等。 2.对PCR体系的一般要求 包括耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、引物、模板等。组成PCR体系的试剂可采用自制、商品化试剂或为供试品检测设计的专用试剂盒，配制和使用过程中应避免污染。自制试剂应尽量现配现用并经验证后方可使用，商品化试剂和专用试剂盒需经过质量确认，并严格遵照说明书使用和储存。 3.方法适用性试验 进行聚合酶链式反应时，应进行方法适用性试验，若测定条件以及供试品来源、部位、加工、制备工艺、干扰物质、储藏等因素可能影响测定结果时，应重新对所用方法的专属性等进行确认。 利用阳性对照、阴性对照、空白对照按“4.测定法'进行方法适用性试验。阴性对照可根据实际情况选择已知不含待测动植物源性成分的样品或不含靶序列的适当基质，检测结果应无DNA条带或DNA条带数量与位置与阳性对照不一致。 采用商品化试剂或试剂盒进行供试品前处理、模板DNA制备、核酸扩增和反应产物检测时，应按说明书操作，并符合试剂盒说明书中的质量控制及方法适用性要求。 4.测定法 (1)供试品前处理 供试品取样应有代表性，取样量和取样部位可按各品种项下的规定或按物料和不同生产阶段产品的检验要求。除另有规定外，可采用适宜方式对供试品进行前处理，如依次用75%乙醇、无菌水清洗擦拭表面以消除交叉污染或细菌污染。固体供试品应用乳钵或研磨仪充分研磨使成粉末，必要时可加液氮适量辅助研磨。液体供试品应充分混匀。 (2)模板制备 按各品种项下规定或按物料和不同生产阶段产品的检验要求，提取供试品模板DNA，模板DNA的质量和浓度应满足核酸扩增的基本要求。 (3)引物 根据样品来源物种的特征DNA片段设计引物。 中药材和饮片引物序列见各品种项下的规定。 动物源性生化药和辅料，除另有规定外，猪、牛及羊源性成分的种属鉴定应分别采用下列引物： 猪源性成分鉴定引物： 上游引物(PidF):5'-GCCTAAATCTCCCCTCAATGG-TA-3'； 下游引物(PidR):5'-ATGAAAGAGGCAAATAGA-TTTTCG-3'； 扩增产物长度为212bp。 牛源性成分鉴定引物： 上游引物(BidF)：5'-GCCATATACTCTCCTTGGT-GACA-3'； 下游引物(BidR)：5'-GTAGGCTTGGGAAIAGTACGA-3，； 扩增产物长度为271bp。 羊源性成分鉴定引物： 上游引物(SidF):5'-TATIAGGCCTCCCCCTTGTT-3'； 下游引物(SidR):5'-CCCTGCTCAIAAGGGAAIAGCC-3'； 扩增产物长度为293bp。 (4)核酸扩增 除另有规定外，核酸扩增可采用PCR反应进行，操作如下： PCR体系应由脱氧核糖核昔三磷酸(dNTP，含脱氧核糖核昔三磷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP一般各200μmol/L)、引物溶液(一般100～500nmol/L)、耐热DNA聚合酶(具有5'→3'聚合酶活性，一般1～2.5U)及其缓冲液(含金属离子如镁离子)、模板和无菌水组成，总体积一般为20～100?μl。 扩增程序应包括变性、退火、延伸三个基本步骤，还可包括预变性、终延伸。预变性时间一般为94℃保温3～5分钟，对于鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例较高的品种，可适当延长预变性时间至10分钟或升高预变性温度至98℃。PCR循环一般分为三步或两步，反应循环次数一般在30～40次，退火温度一般在45～65℃。当PCR反应产物长度小于500bp时，退火延伸时间一般在20～45秒。延伸温度一般为72℃或68℃，可根据使用的DNA聚合酶特性决定。 (5)反应产物检测 如有必要或有规定，在PCR反应完成后，取扩增产物，利用限制性内切酶进行酶切反应。酶切反应体系由限制性内切酶及其缓冲液、扩增产物和无菌水组成，总体积一般为20?μl，可根据酶的活性和酶切反应中加入的扩增产物的量来确定限制性内切酶用量和酶切时间，其中限制性内切酶一般为5～15U，扩增产物一般为5～10?μl。依据限制性内切酶种类选择适宜反应温度进行酶切，酶切反应时间通常为2～4小时，快速限制性内切酶的反应时间不超过1小时。 中药材和饮片限制性内切酶种类见各品种项下的规定。 动物源性生化药和辅料，除另有规定外，猪、牛及羊源性成分的种属鉴定必要时可结合RFLP进行鉴定。猪源性成分鉴定限制性内切酶为Mnl I，牛源性成分鉴定限制性内切酶为Dpn II，羊源性成分鉴定限制性内切酶为Sau3A I。 按附注4 琼脂糖凝胶电泳法(核酸检测用)进行反应产物检测。对于片段小于1000bp的产物，制备的琼脂糖凝胶浓度应在1%～3%之间，对于片段大于或等于1000bp的产物，宜使用浓度为0.5%～1.5%的琼脂糖凝胶。选择合适的DNA分子量标准与反应产物同时进行琼脂糖凝胶电泳，DNA分子量标准应含有用于结果判定的分子量条带。 (6)结果判定 阳性对照 除另有规定外，中药材或饮片应选择对照药材作为阳性对照，动物源性生化药和辅料应分别选择与供试品类型一致且种属来源明确的药用原材料、中间体、原料药、辅料或序列明确的核酸片段作为阳性对照。 空白对照 以无菌水代替供试品。 结果判定方法 分别取供试品、阳性对照和空白对照同法试验，阳性对照的DNA条带位置和数量应符合规定，空白对照中应无DNA条带。当供试品琼脂糖凝胶电泳图谱DNA条带数量与位置与阳性对照一致时，结果判定为阳性。 【附注】 1.PCR须在满足核酸检测基本条件的分子生物学实验室中进行；试剂配制和储存、前处理和模板制备、PCR扩增和产物分析等功能区域应参照《实验室质量控制规范-食品分子生物学检测》(GB/T 27403)予以分隔，或釆取其他有效方式控制。 2.实验室生物安全和污染废弃物的处理应符合《实验室生物安全通用要求》(GB 19489)。 3.检测人员需经上岗培训和在岗持续培训，要求掌握聚合酶链式反应相关专业知识和技能、实验室管理要求，能独立熟练地操作。 4.琼脂糖凝胶电泳法(核酸检测用) (1)试剂配制 电泳缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷(Tris)4.84g，冰醋酸1.14ml，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)0.37g，用醋酸调节pH值至8.0，加水使成1000ml；也可使用其他适宜的电泳缓冲液。 上样缓冲液 取溴酚蓝0.25g，二甲苯蓝FF 0.25g，蔗糖40g，加水使成100ml；也可使用其他适宜的上样缓冲液。 染色剂 溴化乙锭溶液(取溴化乙锭0.5g，加水溶解并稀释至100ml，即得)，也可使用其他合适的核酸染色剂。 (2)操作步骤 制胶 取琼脂糖适量，加入电泳缓冲液，加热使溶胀完全，加入适量核酸染色剂，混匀，倒入插有鲨鱼齿梳的模具中，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。 DNA分子量标准溶液的制备 取DNA分子量标准溶液适量，按所附使用说明进行配制。 上样溶液的制备 取PCR扩增产物溶液适量，按体积比(6:1)加入上样缓冲液，混匀。 上样和电泳 在电泳槽中加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，小心拔出鲨鱼齿梳，取适量上样溶液于凝胶板负极端上样。接通电源，恒压5～10V/cm。当溴酚蓝移至距凝胶底部约1cm处，关闭电源，取出，在紫外光灯(254nm)下检视。 |
医药数据
