本品系由百日咳疫苗原液、白喉类毒素原液及破伤风类毒素原液加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防百日咳、白喉、破伤风。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 混合前单价原液 2.1.1 百日咳疫苗原液制造应符合本品种附录1中的1项的规定。 2.1.2 白喉类毒素原液制造应符合“吸附白喉疫苗”中2.1~2.2项的规定。 2.1.3 破伤风类毒素原液制造应符合“吸附破伤风疫苗”中2.1~2.2项的规定。 2.1.4 原液检定 2.1.4.1 百日咳疫苗 按本品种附录1中2项进行。 2.1.4.2 白喉类毒素 按“吸附白喉疫苗”中3.1项进行。 2.1.4.3 破伤风类毒素 按“吸附破伤风疫苗”中3.1项进行。 2.2 半成品 2.2.1 配制 2.2.1.1 氢氧化铝佐剂稀释 按吸附后之最终浓度，将氢氧化铝原液用注射用水稀释成1.0~1.5mg/ml。加入硫柳汞含量不高于0.1g/L，氯化钠含量补足至8.5g/L。 2.2.1.2 吸附 按计算量将白喉类毒素、破伤风类毒素及百日咳疫苗原液加入已稀释的氢氧化铝内，调pH值至5.8~7.2，使每1ml半成品含百日咳杆菌应不高于9.0×109个菌（应不高于30IOU）；白喉类毒素应不高于20Lf；破伤风类毒素应不高于5Lf。 2.2.2 半成品检定 按3.1项进行。 2.3 成品 2.3.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.3.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.3.3 规格 每瓶0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含百日咳疫苗效价应不低于4.0IU，白喉疫苗效价应不低于30IU，破伤风疫苗效价应不低于40IU（豚鼠法）或60IU（小鼠法）。 2.3.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2 成品检定 3.2.1 鉴别试验 3.2.1.1 百日咳疫苗 按本品种附录2进行效价测定，动物免疫后应产生相应抗体；或加枸椽酸钠或碳酸钠将佐剂溶解，离心沉淀百日咳菌体，加相应抗血清做凝集试验，应呈明显凝集反应（按本品种附录1中2.3项进行）。 3.2.1.2 白喉类毒素 可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物应产生抗体（通则3505）；（2）疫苗加枸椽酸钠或碳酸钠将佐剂溶解后，做絮状试验（通则3506），应出现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），应出现免疫沉淀反应。 3.2.1.3 破伤风类毒素 可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物后应产生破伤风抗体（通则3504）；（2）疫苗加入枸橡酸钠或碳酸钠将吸附剂溶解后做絮状试验（通则3506），应出现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），应出现免疫沉淀反应。 3.2.2 物理检查 3.2.2.1 外观 振摇后应呈均匀乳白色混悬液，不应有摇不散的凝块或异物。 3.2.2.2 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.2.2.3 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.2.3 化学检定 3.2.3.1 pH值 应为5.8~7.2（通则0631）。 3.2.3.2 铝含量 应为0.17~0.26mg/剂（通则3106）。 3.2.3.3 硫柳汞含量 应不高于0.05mg/剂（通则3115）。 3.2.3.4 游离甲醛含量 应不高于0.1mg/剂（通则3207第一法）。 3.2.4 效价测定 3.2.4.1 百日咳疫苗 按本品种附录2进行。每1次人用剂量中百日咳疫苗的免疫效价应不低于4.0IU，且95%可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求，可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值（如用概率分析法时应用加权几何平均）计算，达到上述要求判为合格。 3.2.4.2 白喉疫苗 每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU（通则3505）。 3.2.4.3 破伤风疫苗 依法测定（通则3504），每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU（通则3504豚鼠法），或应不低于60IU（通则3504小鼠法）。 3.2.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.6 特异性毒性检查 3.2.6.1 百日咳疫苗 应符合本品种附录3的规定。 3.2.6.2 白喉、破伤风疫苗 用体重250~350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两侧，每侧1.25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为18个月；百日咳疫苗原液保存时间超过18个月者，自原液采集之日起，疫苗总有效期不得超过36个月。 5 附录 附录1 百日咳疫苗原液制造及检定要求 附录2 百日咳疫苗原液效价测定方法 附录3 百日咳疫苗原液毒性检查方法 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 附录1 百日咳疫苗原液制造及检定要求 本品系用百日咳杆菌I相菌种，经培养后，取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以PBS稀释制成。用于制备百白破联合疫苗。 1 制造 1.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 1.1.1 名称及来源 采用百日咳杆菌I相CMCC 58001、58003、58004、58031和沪64-21株。 1.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 1.1.3 种子批的传代 工作种子批菌种启开后传代不应超过10代用于生产。 1.1.4 种子批的检定 1.1.4.1 培养特性 于包-姜（Bordet-Gengou）培养基或其他适宜培养基上培养，各菌株应具有典型的形态，葡萄糖、尿素酶、硝酸盐、枸椽酸盐、半固体（动力）营养琼脂结果均应为阴性。 1.1.4.2 血清学试验 菌种经35~37℃培养40~48小时，取适量菌苔混悬于0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS内，制成适宜浓度的菌悬液，与I相参考血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时进行Fim2、Fim3血清学检测，应为阳性。 1.1.4.3 皮肤坏死试验 菌种经35~37℃培养40~48小时，取适量菌苔混悬于PBS内稀释成不同浓度的菌液；取家兔（或豚鼠）至少2只，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔（或豚鼠）皮内0.1ml，经72小时观察注射部位皮肤反应，如其中有1只家兔（或豚鼠）在注射含菌4.0×107以下稀释度的部位出现出血性坏死者，为阳性反应，判为合格。 1.1.4.4 毒力试验 用体重16~18g的小鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培养20~24小时、以PBS稀释的菌液0.05ml，观察14天，记录小鼠生死情况，按Reed-Muench法计算LD50，1LD50的菌数应不高于1.2×108。 1.1.4.5 效价测定 用适宜方法杀菌后，按本品种附录2进行。 1.1.5 菌种保存 种子批应冻干保存于8℃及以下。 1.2 原液 1.2.1 生产用种子 工作种子批菌种启开后，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基或其他适宜培养基，于35~37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，工作种子批启开后用于生产时不应超过10代。 1.2.2 培养 用适宜方法培养，培养时间不得超过48小时，经纯菌检查后，用适当方法收集菌体，混悬于pH7.0~7.4的PBS中，制成菌悬液。 1.2.3 纯菌检查 菌悬液应逐瓶（罐）抽样，接种普通琼脂斜面及改良包-姜培养基（或活性炭半综合培养基）各1管，置35~37℃培养2天，然后于24~26℃培养1天，有杂菌生长者应废弃。 1.2.4 杀菌 采用终浓度小于0.1%甲醛溶液杀菌，亦可用经批准的其他适宜的杀菌剂和杀菌方法。 1.2.5 杀菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。并同时接种改良包-姜培养基（或活性炭半综合培养基），分别置35~37℃培养72小时和24~26℃培养24小时。有微生物生长者应废弃。不同菌株不同日制造的原液应分别合并。合并后，可加适量抑菌剂，并保存于2~8℃。 2 检定 2.1 浓度测定 每瓶原液应按“中国细菌浊度标准”测定浓度，稀释疫苗时即按此浓度计算。 2.2 染色镜检 每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌，至少观察10个视野，应无杂菌。 2.3 血清学试验 每瓶原液应与I相参考血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半，若未能达到者，应做效价测定，合格后方可使用；同时进行Fim2、Fim3检测。 2.4 效价测定 每批原液进行效价测定按本品种附录2进行。 2.5 无菌检查 每瓶原液依法检查（通则1101），应符合规定。 2.6 特异性毒性检查 按本品种附录3进行。 3 保存及有效期 于2~8℃保存。自收菌之日起，疫苗总有效期为36个月。 附录2 百日咳疫苗原液效价测定方法 1 试验材料 1.1 动物 体重10~12g同性或雌雄各半的NIH小鼠。 1.2 百日咳参考菌苗 由国家药品检定机构分发。将该参考菌苗按标示量进行稀释。 1.3 供试品 将供试品稀释至合适的浓度。半数有效剂量（ED50）应在所用的稀释浓度范围之内。 1.4 攻击菌及攻击菌液 1.4.1 攻击菌为百日咳杆菌CMCC 58030（18323）菌株。 1.4.2 培养基 可用包-姜培养基（含羊血20%~30%）或其他适宜的培养基。 1.4.3 培养温度及时间 置35~37℃培养，第1代不超过72小时，此代菌种可置2~8℃保存2周。攻击时菌种的培养时间为20~24小时。 1.4.4 攻击菌液的制备 将培养20~24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮至适量的0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS（pH7.2~7.4）中，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用适宜稀释液稀释成每0.03ml含菌8.0×104，作为试验组的攻击菌液。然后再连续稀释，使每0.03ml分别含8000个菌、800个菌、80个菌及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液作为对照组的攻击菌液，用于测定攻击菌液的LD50。 2 试验步骤 2.1 免疫 至少使用3个稀释度的参考菌苗和供试品，分别免疫小鼠（每个稀释度之间不超过5倍），每稀释度免疫20只小鼠（同性或雌雄各半），每只小鼠各腹腔注射0.5ml。同时饲养小鼠55~60只作对照用。 2.2 攻击 小鼠免疫后14~16天，此期间内参考菌苗和供试品的每个稀释度的免疫小鼠的健存率应至少为94%。每只小鼠用0.25ml注射器脑腔内攻击0.03ml菌液（含菌8.0×104）。试验应按1.4.4的要求，设立对照组进行攻击菌的LD50的测定，每组设定5个稀释度，对照组每稀释度攻击10只小鼠。 3 结果观察 小鼠攻击后观察14天。攻击后第3天，试验组动物每组至少16只，逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物也按死亡计算。 4 结果计算和判定 按质反应平行线法计算供试品效价。 供试品按成品疫苗浓度稀释后，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU，且95%可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均）来计算。达到上述要求判为合格。 5 附注 5.1 试验成立的条件 5.1.1 参考菌苗和供试品的ED50应在最大和最小免疫剂量之间。 5.1.2 参考菌苗和供试品的剂量反应曲线在平行性及直线性上无明显偏差。 5.1.3 按Reed-Muench法计算LD50，攻击菌的LD50应在100~1000的范围。 5.2 工作起止时间 自攻击菌制备（开始刮菌）至注射完最后1只小鼠不得超过2.5小时。 附录3 百日咳疫苗原液毒性检查方法 1 试验材料 1.1 动物 选用体重14~16g NIH小鼠（同性或雌雄各半）。注射前2小时禁止喂食，注射后恢复供食，并于注射前称取各组小鼠的总体重。 1.2 供试品 供试品可用0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS（pH7.2~7.4）稀释，其菌数含量应不低于每1次人用剂量之半。 2 试验步骤 2.1 每批供试品注射小鼠不少于10只（同性或雌雄各半），每只小鼠腹腔注射稀释的原液0.5ml。 2.2 对照组取同数量同体重的小鼠（同性或雌雄各半），腹腔注射稀释用0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS（pH7.2~7.4）0.5ml，其中抑菌剂浓度应与供试品中的浓度相同。 3 结果观察及判定标准 3.1 注射后72小时及第7天分别称取试验组及对照组小鼠的总体重。 3.2 试验组的小鼠注射后72小时的总体重应不低于注射前的总体重。 3.3 试验组7天后小鼠平均增加的体重应不少于对照组平均增加体重的60%。 3.4 试验组的小鼠不得有死亡。 试验结果符合上述要求，该批原液毒性试验判为合格。试验结果若达不到上述要求，原液可放置2~8℃保存3~4个月再进行复试。仍达不到上述要求，该批原液的毒性判为不合格。 |
医药数据
