1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程细胞 2.1.1 名称及来源 人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-（二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞）细胞系。 2.1.2 细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 2.1.3.1 外源因子检查 细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。 2.1.3.2 细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.3 人促红素表达量 应不低于原始细胞库细胞的表达量。 2.1.3.4 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.2 原液 2.2.1 细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能新生牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。新生牛血清的质量应符合规定（通则3604）。 2.2.2 生产用细胞培养液 生产用细胞培养液应不含牛血清和抗生素。 2.2.3 细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2.2.4 分离纯化 收集的培养液采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的人促红素，除菌过滤后即为人促红素原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装及冻干 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中，制品温度应不高于30℃。 2.4.3 规格 1000IU/瓶；2000IU/瓶；3000IU/瓶；4000IU/瓶 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 蛋白质含量 用4g/L碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5～2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长276～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax ，将Amax 对应波长代入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。按下式计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。 3.1.2.1 体内法 依法测定（通则3522）。 3.1.2.2 体外法 按酶联免疫吸附法试剂盒说明书测定。 3.1.3 体内比活性 每1mg蛋白质应不低于1.0×105IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶的胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm，长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠---1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量应为20～100μg，在波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶的胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。 3.1.6 紫外光谱 依法测定（通则0401），用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至0.5～2mg/ml，在光路lcm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰应为279nm±2nm；最小吸收峰应为250nm±2nm；在320～360nm处应无吸收峰。 3.1.7 等电聚焦 取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40%pH3～5的两性电解质溶液1.05ml、40%pH3～10的两性电解质溶液0.45ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N,N,N’,N’-四甲基乙二胺15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl（浓度应在每1ml含0.5mg以上），照等电聚焦电泳法（通则0541第六法）进行，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。 3.1.8 唾液酸含量 每lmol人促红素应不低于10.0mol（通则3102）。 3.1.9 外源性DNA残留量 每10000IU人促红素应不高于l00pg（通则3407）。 3.1.10 CHO细胞蛋白质残留量 采用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。 3.1.11 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每10000IU人促红素应小于2EU。 3.1.12 牛血清白蛋白残留量 依法测定（通则3411），应不高于蛋白质总量的0.01%。 3.1.13 肽图 供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（通则3405），其中加入胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱（25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm），柱温为45℃±0.5℃;流速为每分钟0.75ml；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。 3.1.14 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。 3.2 半成品检定 3.2.1 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU。 3.2.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 除复溶时间、水分测定和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体。 3.3.2.2 复溶时间 加入标示量的灭菌注射用水，复溶时间应不超过2分钟。 3.3.2.3 可见异物 依法检查（通则0904），应符合规定。 3.3.2.4 装量差异 依法检查（通则0102），应符合规定。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 水分 应不高于3.0%（通则0832）。 3.3.3.2 pH值 依法测定（通则0631），应符合批准的要求。 3.3.3.3 人血白蛋白含量勘误总蛋白质含量 若制品中加入人血白蛋白作稳定剂，则应符合批准的要求（通则0731第二法）。 3.3.3.4 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.4 生物学活性 3.3.4.1 体外法 按酶联免疫吸附法试剂盒说明书测定，应为标示量的80%～120%。 3.3.4.2 体内法 依法测定（通则3522），应为标示量的80%～140%。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.6 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU；5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU。 3.3.7 异常毒性检查 依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。 4 稀释剂 稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。 灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。 5 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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