C639H1003O196N171S8 Mr 14473.35 Da 本品系由高效表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（简称人粒细胞巨噬细胞刺激因子）基因的大肠埃希菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的人粒细胞巨噬细胞刺激因子，加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂、抑菌剂，不含抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人粒细胞巨噬细胞刺激因子工程菌株系由具有表达人粒细胞巨噬细胞刺激因子基因的大肠埃希菌菌株。人粒细胞巨噬细胞刺激因子cDNA由人工合成。 2.1.2 种子批的建立、传代及保存 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种LB琼脂平板 应呈典型大肠埃希菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 应为典型的革兰氏阴性杆菌。 2.1.3.3 对抗生素的抗性 应与原始菌种相符。 2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型大肠埃希菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5 生化反应 应符合大肠埃希菌生化反应特性。 2.1.3.6 人粒细胞巨噬细胞刺激因子表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7 质粒检查 该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。 2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（含适量四环素）中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理菌体。 2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，过滤后即为人粒细胞巨噬细胞刺激因子原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 采用的基质应符合凝胶剂基质要求（通则0114）。 2.3.1 配制 应按经批准的配方进行。 2.3.2 凝胶制备 应按经批准的工艺进行。凝胶应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。 2.3.3 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0114有关规定。 2.4.3 规格 100μg/l0g/支 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0114有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（通则3526）。量取胎牛血清（FBS）100ml、lmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）10ml、104IU/ml青链霉素溶液10ml，加入RPMI 1640培养液880ml中，摇匀，2～8℃保存，作为基础培养液；取基础培养液加1%谷氨酰胺、人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每1ml含5ng，作为完全培养液；以二甲亚砜为裂解液；在96孔细胞培养板中，每孔分别留100μl标准品溶液/供试品溶液；向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入每1ml含（1.8～2.0）×105个细胞的悬液，培养40～52小时；每孔加入MTT溶液后培养4～5小时。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每lmg蛋白质应为（1.0～1.6）×107IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 取本品，加流动相稀释制成每1ml中含lmg的溶液作为供试品溶液。照高效液相色谱法（通则0512）试验，用适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；以0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液（取磷酸氢二钠10.3g、磷酸二氢钠3.36g与氯化钠2.92g，加水1000ml使溶解，调节pH值至7.0）为流动相；检测波长为280nm。精密量取供试品溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以人粒细胞巨噬细胞刺激因子色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，人粒细胞巨噬细胞刺激因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 相关蛋白 依法测定（通则0512）。色谱柱采用四烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：C4柱，4.6mm×15cm，粒径5μm或其他适宜的色谱柱），柱温为室温；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A，以0.1%三氟乙酸-90%乙腈的水溶液为流动相B；流速为1.2ml/min；在波长214nm处检测；按下表进行梯度洗脱。 用稀释液（pH7.0的磷酸盐缓冲液）将供试品稀释至每1ml中约含0.5mg，作为供试品溶液；用稀释液将对照品稀释至每lml中约含0.5mg，作为对照品溶液A；取对照品溶液A与每1ml中约含0.125mg的人或牛血清白蛋白溶液（溶剂为稀释液），按体积比1：4混匀作为对照品溶液B。取供试品溶液与对照品溶液A、B各100μl注入液相色谱仪。 供试品溶液与对照品溶液A、B图谱中，粒细胞巨噬细胞刺激因子主峰的保留时间应一致，约为20分钟。对照品溶液B图谱中，主峰与人或牛血清白蛋白峰的分离度应不小于2，重复进样（不少于4次）所得主峰峰面积的RSD应不大于1.5%。 按面积归一化法只计算保留时间为5～30分钟的相关蛋白峰面积，单个相关蛋白峰面积应大不于总面积的1.5%，所有相关蛋白峰面积应不大于总面积的4.0%。 3.1.6 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为14.5kD±1.4kD。 3.1.7 外源性DNA残留量 每1次人用剂量应不高于10ng（通则3407）。 3.1.8 宿主菌蛋白质残留量 应不高于蛋白质总量的0.10%（通则3412）。 3.1.9 残余抗生素活性 依法测定（通则3408），不应有残余四环素活性。 3.1.10 等电点 主区带应为4.7～5.7，且供试品的等电点图谱应与对照品一致（通则0541第六法）。 3.1.11 紫外光谱 取本品适量，加水或0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释至每1ml含100～500μg的溶液，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为279nm±3nm（通则0401）。 3.1.12 肽图 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定，N端序列应为： Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Gln-Pro-Trp-Glu-His。 3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为微黄色透明凝胶。 3.3.2.2 装量 依法检查（通则0114），应符合规定。 3.3.2.3 均匀性 取样品3支，分别称取0.5g置1ml离心管中，每分钟10000转离心30分钟，应无分层及沉淀。 3.3.3 化学检定 pH值 取本品1.0g，加水20ml，搅拌均匀，依法测定（通则0631），pH值应为6.0～7.5。 3.3.4 对羟基苯甲酸甲酯含量 取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含对羟基苯甲酸甲酯1μg的溶液，作为供试品溶液。照高效液相色谱法（通则0512）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂；以甲醇-1%冰醋酸（60：40）为流动相；检测波长为254nm。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对羟基苯甲酸甲酯对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，对羟基苯甲酸甲酯含量应为0.105%～0.195%。 3.3.5 聚山梨酯80含量 称取凝胶0.05g于离心管中，依法测定（通则3203），含量应为0.07%～0.13%。 3.3.6 生物学活性 按3.1.1项进行。供试品生物学活性应为标示量的80%～150%。 3.3.7 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃避光密闭贮藏和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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