1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人干扰素α2b工程菌株系由带有人干扰素α2b基因的重组质粒转化的大肠埃希菌、酿酒酵母或假单胞菌菌株。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种琼脂平板 应分别呈典型大肠埃希菌、酿酒酵母集落或腐生型假单胞菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 釆用大肠埃希菌为载体的，其菌株应为典型的革兰氏阴性杆菌；采用酿酒酵母为载体的，其菌株应为典型的酵母菌形态；采用腐生型假单胞菌为载体的，其菌株应呈棒状，可运动，有荚膜，无芽弛，涂片染色后应呈典型的革兰氏阴性。 2.1.3.3 对抗生素的抗性 采用大肠埃希菌为载体的，其抗生素抗性应与原始菌种相符勘误采用大肠埃希菌或假单胞菌为载体的，其抗生素抗性应与原始菌种相符。 2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做） 釆用大肠埃希菌为载体的，其菌种应为典型大肠埃希菌形态；采用腐生型假单胞菌为载体的，其菌种应为腐生型假单胞菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 2.1.3.5 生化反应 采用大肠埃希菌为载体的，其菌种应符合大肠埃希菌生化反应特性；采用腐生型假单胞菌为载体的，其菌种的生化反应须不液化明胶，不水解淀粉和聚β－羟基丁酸酯（通则3605），不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。 2.1.3.6 干扰素表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.7 表达的干扰素型别 应用抗α2b型干扰素血清做中和试验，证明型别无误。 2.1.3.8 质粒检查 采用大肠埃希菌或腐生型假单胞菌为载体的，其菌种中转化质粒的酶切图谱应分别与原始重组质粒的相符。 2.1.3.9 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 采用大肠埃希菌为载体的，其菌种的目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。勘误采用大肠埃希菌或假单胞菌为载体的，其菌种的目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 2.1.3.10 干扰素基因稳定性检查 采用酿酒酵母为载体的，将菌种涂SD琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测干扰素基因，阳性率应不低于95%。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（大肠埃希菌培养基和假单胞菌培养基可含适量抗生素）中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理菌体。收集到的菌体可在-20℃以下保存，保存时间应不超过1年。 2.2.5 初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人干扰素α2b原液。如需存放，应规定时间和温度。勘误经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，根据产品具体情况，可加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人干扰素α2b原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.7 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。 将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装及冻干 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 2.4.3 规格 300万IU/瓶；500万IU/瓶 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0102有关规定。 3 检定 2.1 原液检定 2.1.1 生物学活性 依法测定（通则3523）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×108IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测，以干扰素色谱峰计算的理论板数应不低于1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 相关蛋白 依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：C18柱，4.6mm×25cm，粒径5μm或其他适宜的色谱柱），柱温为室温；以0.2%三氟乙酸-30%乙睛的水溶液为流动相A，以0.2%三氟乙酸-80%乙睛的水溶液为流动相B；流速为1.0ml/min；在波长210nm处检测；按下表进行梯度洗脱。 对照品溶液及供试品溶液图谱中，干扰素主峰的保留时间约为20分钟。对照品溶液图谱中，氧化型峰相对于主峰的保留时间约为0.9，氧化型峰与主峰的分离度应不小于1.0。 按面积归一化法只计算相对于主峰保留时间为0.7～1.4的相关蛋白峰面积，单个相关蛋白峰面积应不大于总面积的3.0%，所有相关蛋白峰面积应不大于总面积的5.0%。 3.1.6 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为19.2kD±1.9kD。 3.1.7 外源性DNA残留量 每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。 3.1.8 鼠IgG残留量 如采用单克隆抗体亲和色谱法纯化，应进行本项检定。每1次人用剂量鼠IgG残留量应不高于l00ng（通则3416）。 3.1.9 宿主菌蛋白质残留量 采用大肠埃希菌表达的制品应不高于蛋白质总量的0.10%（通则3412）。采用酵母菌表达的制品应不高于蛋白质总量的0.050%（通则3414）。采用假单胞菌表达的制品蛋白残留量应不高于蛋白质总量的0.02%（通则3413）。 3.1.10 残余抗生素活性 依法测定（通则3408），采用大肠埃希菌或假单胞菌表达的制品，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.1.11 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。 3.1.12 等电点 采用大肠埃希菌表达的制品主区带应为4.0～6.7；采用酵母菌或假单胞菌表达的制品，主区带应为5.7～6.7。供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。 3.1.13 紫外光谱 用水或0.85%～0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为278nm士3nm（通则0401）。 3.1.14 肽图 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.15 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为： （Met）-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。 3.2 半成品检定 3.2.1 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每300万IU应小于10EU。 3.2.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 除水分测定、装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 2.3.2.1 外观 应为白色或微黄色薄壳状疏松体。按标示量加入灭菌注射用水后应迅速复溶为澄明液体。 3.3.2.2 可见异物 依法检查（通则0904），应符合规定。 3.3.2.3 装量差异 依法检查（通则0102），应符合规定。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 水分 应不高于3.0%（通则0832）。如含葡萄糖，则水分应不高于4.0%。 3.3.3.2 pH值 应为6.5～7.5（通则0631）。 3.3.3.3 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.4 生物学活性 应为标示量的80%～150%（通则3523）。 3.3.5 残余抗生素活性 依法测定（通则3408），采用大肠埃希菌或假单胞菌表达的制品，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.3.6 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.7 细菌内毒素检查 依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。 3.3.8 异常毒性检查 依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合要求。 4 稀释剂 稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。 灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。 5 保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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