本品系由重组CHO细胞表达的乙型肝炎（简称乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防乙型肝炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物应符合“凡例'的有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 2.1.1 细胞名称及来源 生产用细胞为DNA重组技术获得的表达HBsAg的CHO细胞C28株。 2.1.2 细胞库的建立及传代 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 各级细胞库代次应不超过批准的限定代次。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。 2.1.3.1 细胞外源因子检查 细菌和真菌、支原体、细胞外源病毒因子检查均应为阴性。 2.1.3.2 细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标志物等任何方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 （1）细胞染色体检查 用染色体分析法进行检测，染色体应为20条。 （2）目的蛋白鉴别 采用酶联免疫吸附法（通则3429）检查，应证明为HBsAg。 2.1.3.3 HBsAg表达量 主细胞库及工作细胞库细胞HBsAg表达量应不低于原始细胞库的表达量。 2.1.4 保存 细胞库细胞应保存于液氮中。 2.2 原液 2.2.1 细胞制备 取工作细胞库细胞，复苏培养后，经胰蛋白酶消化，置适宜条件下培养。 2.2.2 培养液 采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。 2.2.3 细胞收获 培养适宜天数后，弃去培养液，换维持液继续培养，当细胞表达HBsAg达到1.0mg/L以上时收获培养上清液。根据细胞生长情况，可换以维持液继续培养，进行多次收获。应按规定的收获次数进行收获。每次收获物应逐瓶进行无菌检查。收获物应于2~8℃保存。 2.2.4 对照细胞外源病毒因子检查 依法检查（通则3302），应符合规定。 2.2.5 收获物合并 来源于同一细胞批的收获物经无菌检查合格后可进行合并。 2.2.6 纯化 合并的收获物经澄清过滤，采用柱色谱法进行纯化，脱盐，除菌过滤后即为纯化产物。 2.2.6.1 纯化产物合并 同一细胞批来源的HBsAg纯化产物检定合格后，经除菌过滤后可进行合并。 2.2.6.2 纯化产物检定 按3.1项进行。 2.2.6.3 纯化产物保存 于2~8℃保存不超过3个月。 2.2.7 甲醛处理 合并后的HBsAg纯化产物中按终浓度为200μg/ml加入甲醛，置37℃保温72小时。 2.2.8 除菌过滤 甲醛处理后的HBsAg经超滤、浓缩、除菌过滤后即为原液（亦可在甲醛处理前进行除菌过滤）。 2.2.9 原液检定 按3.2项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制 按最终蛋白质含量为10μg/ml或20μg/ml进行配制。加入氢氧化铝佐剂吸附后，即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.3项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量为0.5ml，含HBsAg 10μg；每1次人用剂量为1.0ml，含HBsAg 10μg或20μg。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 纯化产物检定 3.1.1 蛋白质含量 应为100~200μg/ml（通则0731第二法）。 3.1.2 特异蛋白带 采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（通则0541第五法），分离胶胶浓度15%，浓缩胶胶浓度5%，上样量为5μg，银染法染色。应有分子质量23kD、27kD蛋白质带，可有30kD蛋白质带及HBsAg多聚体蛋白质带。 3.1.3 纯度 采用高效液相色谱法（通则0512）测定，用SEC-HPLC法：亲水树脂体积排阻色谱柱，排阻极限1000kD，孔径100nm，粒度17μm，直径7.5mm，长30cm；流动相为0.05mol/L PBS（pH6.8）；检测波长280nm，上样量100μl。按面积归一化法计算HBsAg纯度，应不低于95.0%。 3.1.4 细菌内毒素检查 每10μg蛋白质应小于10EU（通则1143凝胶限度试验）。 3.2 原液检定 3.2.1 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.2 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 3.2.3 蛋白质含量 应在100~200μg/ml（通则0731第二法）。 3.2.4 特异蛋白带 按3.1.2项进行。 3.2.5 牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（通则3411）。 3.2.6 纯度 按3.1.3项进行。 3.2.7 CHO细胞DNA残留量 应不高于10pg/剂（通则3407）。 3.2.8 CHO细胞蛋白质残留量 采用酶联免疫吸附法（通则3429）测定，应不高于总蛋白质含量的0.05%。 3.2.9 细菌内毒素检查 每10μg蛋白质应小于5EU（通则1143凝胶限度试验）。 3.2.10 N端氨基酸序列（每年至少测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端氨基酸序列应为： Met-Glu-Asn-Thr-Ala-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。 3.3 半成品检定 3.3.1 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3.2 细菌内毒素检查 应小于10EU/剂（通则1143凝胶限度试验）。 3.3.3 吸附完全性试验 将供试品于6500g离心5分钟取上清液，依法测定（通则3501）参考品、供试品及其上清液中HBsAg含量。以参考品HBsAg含量的对数对其相应吸光度对数作直线回归，相关系数应不低于0.99，将供试品及其上清液的吸光度值代入直线回归方程，计算其HBsAg含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。 式中 P为吸附率，%; cs为供试品上清液的HBsAg含量，μg/ml； ct为供试品的HBsAg含量，μg/ml。 3.4 成品检定 3.4.1 鉴别试验 采用酶联免疫吸附法（通则3429）检查，应证明含有HBsAg。 3.4.2 外观 应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。 3.4.3 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.4.4 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应符合批准的要求。 3.4.5 化学检定 3.4.5.1 pH值 应为5.5~6.8（通则0631）。 3.4.5.2 铝含量 应不高于0.43mg/ml（通则3106）。 3.4.5.3 游离甲醛含量 应不高于50μg/ml（通则3207第二法）。 3.4.6 效价测定 将疫苗连续稀释，每个稀释度接种4~5周龄未孕雌性NIH或BALB/c小鼠20只，每只腹腔注射1.0ml，用参考疫苗做平行对照，4~6周后采血，采用酶联免疫吸附法（通则3429）或其他适宜方法测定抗-HBs，计算ED50，供试品ED50（稀释度）/参考疫苗ED50（稀释度）之值应不低于1.0。 3.4.7 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.4.8 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 3.4.9 细菌内毒素检查 应小于10EU/剂（通则1143凝胶限度试验）。 3.4.10 抗生素残留量 生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429）检测，应不高于50ng/剂。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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