(CTLL-2细胞/MTT比色法) 本法系依据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率不同，以此检测IL-2的生物学活性。 试剂 (1)RPMI1640培养液 取RPMI1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。 (2)基础培养液 量取新生牛血清(FBS)10ml，加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。 (3)完全培养液 量取基础培养液100ml，加人白介素-2至终浓度为每1ml含400~800IU。4℃保存。 (4)PBS 称取氯化钠8g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液 称取MTT 0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μl滤膜过滤除菌。4℃避光保存。 (6)裂解液 15%十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过12个月。 CTLL-2细胞 应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后48~60小时用于人白介素-2生物学活性测定。 标准品溶液的制备 取人白介素-2生物学活性测定的国家标准品，按使用说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml约含200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 测定法 CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每1ml含6.0×105个细胞的细胞悬液，于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时；然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5%二氧化碳条件下保温18~24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处 理，并按下式计算结果： 式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml； Ds为供试品预稀释倍数； Dr为标准品预稀释倍数； Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Et为标准品半效量的稀释倍数。 注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。 |
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