分子式： C267H404N72O78S6 分子量：6062.89Da 本品系由含有可高效表达甘精胰岛素基因的工程化细胞，经发酵、分离、高度纯化、结晶和干燥制成的原料药。甘精胰岛素为21A-甘氨酸-30Ba-L-精氨酸-30Bb-L-精氨酸-人胰岛素，在结构上与人胰岛素相比在A链的21位置由甘氨酸代替天门冬酰胺；在B链的C末端增加了2个额外氨基酸，即精氨酸（B31）和精氨酸（B32）。按干燥品计，含甘精胰岛素应为95.0%～105.0%。 每1单位甘精胰岛素相当于0.0364mg。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程细胞 工程菌菌种名称、来源及种子批检定应符合批准的要求。 2.2 原料 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批细胞接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。如系大肠埃希菌表达，发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理细胞。 2.2.5 初步纯化及高度纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 过滤、结晶及干燥 经初步纯化和高度纯化后，采用经批准的结晶工艺及干燥工艺对纯化收集物进行结晶和干燥，干燥品即为甘精胰岛素原料药。 2.2.7 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.2.8 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 3 检定 3.1 性状 本品为白色或类白色粉末。 3.2 鉴别 3.2.1 在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。 3.2.2 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.4mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH9.0）98 μl、V8酶溶液（5U/μl）4μl与水78μl，混匀，置37℃水浴中1小时后，加85%磷酸3μl终止反应，作为供试品溶液；另取甘精胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（通则0512）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（3.5μm）；以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（90∶10）为流动相A，乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温40℃；检测波长为214nm。 取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致，片段Ⅱ与片段Ⅲ之间的分离度不小于3.4，片段Ⅱ与片段Ⅲ的拖尾因子均不得过1.5。 3.3 检查 3.3.1 有关物质 照3.4项进行，记录色谱图，按峰面积归一化法计算。最大有关物质不得过0.4%，总有关物质不得过1.0%。 3.3.2 高分子蛋白质 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含2mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法（通则0514）试验。以亲水硅胶为填充剂（5～10μm）；以冰醋酸-乙腈-水（200ml∶300ml∶400ml，混匀后，用25%氨水调节pH值至3.0，加水至1000ml）为流动相，流速为0.5ml/min，检测波长为276nm。甘精胰岛素峰的保留时间应在16～25分钟。取甘精胰岛素适量，100℃加热1.5～3小时，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含2mg的溶液，取100μl注入液相色谱仪，高分子蛋白质峰高与甘精胰岛素峰和高分子蛋白质峰之间的谷高之比应不小于2.0。取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，扣除保留时间大于甘精胰岛素主峰的其他峰面积，按峰面积归一化法计算，保留时间小于甘精胰岛素主峰的所有峰面积之和不得大于0.3%。 3.3.3 锌 精密称取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含锌0.4～0.8μg的溶液，摇匀。另精密量取锌单元素标准溶液适量，用0.01mol/L盐酸溶液分别稀释成每1ml中锌含量为0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg和1.0μg的锌标准溶液。照原子吸收分光光度法（通则0406第一法），在213.9nm的波长处测定吸光度，按干燥品计，含锌量不得大于0.80%。 3.3.4 干燥失重 取本品0.2g，105℃干燥至恒重，减失重量不得过8.0%（通则0831）。 3.3.5 炽灼残渣 取本品约0.2g，依法检查（通则0841），遗留残渣不得过2.0%。 3.3.6 微生物限度 取本品0.3g，依法检查（通则1105），每1g供试品中需氧菌总数不得过300cfu。 3.3.7 细菌内毒素 取本品，依法检查（通则1143），每1mg甘精胰岛素中含细菌内毒素的量应小于10EU。 3.3.8 宿主蛋白质残留量 取本品适量，依法检查（通则3412或3414），或釆用经验证并批准的适宜方法检查，每1mg甘精胰岛素中宿主蛋白残留量不得过10ng。 3.3.9 宿主DNA残留量 取本品适量，依法检查（通则3407），或采用经批准的方法检查，每1.5mg甘精胰岛素中宿主DNA残留量不得过10ng。 3.3.10 抗生素残留量 如种子液制备及后续生产使用了抗生素，依法检查（通则3408），或采用经批准的方法检查，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.3.11 生物学活性（至少每年测定一次） 取本品适量，依法检查（通则1211），每组的实验动物数可减半，实验釆用随机设计，照生物检定统计法（通则1431）中量反应平行线测定随机设计法计算效价，每1mg甘精胰岛素的效价不得少于15单位。 3.3.12 N末端氨基酸序列（至少每年测定一次） 取本品，用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定。 A链N末端15个氨基酸序列： Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln； B链N末端15个氨基酸序列： Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。 3.3.13 单链前体 工艺中如有单链前体，应采用经批准的方法及限度进行控制。 3.4 含量测定 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；取氯化钠18.4g，加磷酸盐缓冲液（取无水磷酸二氢钠20.7g，加水800ml溶解，再用85%磷酸调节pH值至2.5，加水至1000ml）250ml溶解，加乙腈250ml，混匀后，用水定容至1000ml，0.45μm滤膜过滤，作为流动相A；另取氯化钠3.2g，加上述磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈650ml，混匀后，用水定容至1000ml，0.45μm滤膜过滤，作为流动相B；流速为每分钟1.0ml，柱温35℃，检测波长为214nm。按下表进行梯度洗脱。 取甘精胰岛素注射液适量，用0.01mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.0，30℃放置2～3周，使3B -琥珀酰亚胺-甘精胰岛素（与主峰相对保留时间为0.97～0.98）含量为0.5%～1.5%，作为系统适用性溶液。取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，3B-琥珀酰亚胺-甘精胰岛素峰高与甘精胰岛素峰和3B-琥珀酰亚胺-甘精胰岛素峰之间的谷高之比应大于2.0，甘精胰岛素峰的拖尾因子应不大于1.8。 测定法 取本品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.4mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取甘精胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。 4 保存、运输及有效期 避光，密闭，在－15℃及以下保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 |
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