本法系将供试品或供试品溶液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。 试验用细胞 推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。试验时采用传代48~72小时生长旺盛的细胞。 试验前的准备 与样品及细胞接触的所有器具均需无菌。必要时可采用湿热灭菌，如115℃保持30分钟；干热灭菌，如250℃保持30分钟或180℃保持2小时。 供试品溶液的制备 浸提介质的选择宜反映出浸提的目的，优先选用含血清哺乳动物细胞培养基作为浸提介质。除另有规定外，按品种项下规定的浸提介质制成供试品溶液。将供试品切成0.5cm×2cm条状，用湿热灭菌或紫外线照射消毒后，置玻璃容器内。除另有规定外，按表1选择浸提比例，使浸提液浸没供试品，按表2选择浸提条件（若采用含血清培养基，应用37℃±1℃的条件）。 表1供试品表面积或质量与浸提介质体积的比例 第一法 相对増殖度法 阴性对照液 制备为不加供试品的细胞培养液。 阳性对照液 制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。 检查法 取33个培养瓶，分别加入4×104个/ml浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置37℃±1℃，5%±1%CO2的条件下培养24小时。培养24小时后弃去原培养液。 阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液； 阳性对照组：取10个培养瓶加入5ml阳性对照液； 试验组：取10个培养瓶加入5ml含50%供试品溶液的细胞培养液，置37℃±1℃，5%±1%CO2的条件下继续培养7天。 细胞形态学观察和计数：在更换细胞培养液的当天，取3瓶阴性对照组，并在更换后第2、4、7天，每组各取3瓶进行细胞形态观察和细胞计数。 毒性评定 细胞形态分析标准按表3规定。 细胞相对增殖度分级标准按表4规定。 根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）。 结果评价 试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。试验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。试验组相对增殖度为3~5级判为不合格。 第二法 琼脂扩散法 本法适用于弹性体细胞毒性的测定。样品中可滤取的化学物质扩散时，琼脂层可起到隔垫的作用保护细胞免受机械损伤。材料中的浸提物将通过一张滤纸（表面积不小于l00mm2）被进行试验。 阴性对照制备 取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。按照供试品溶液制备项下的规定进行。 阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC）。按照供试品溶液制备项下的规定进行。可采用10%二甲基亚砜（DMSO）溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。 检查法 取细胞悬浮液（1×105个/ml）7ml，均匀分散至直径60mm的培养皿中。置于含5%±1%CO2气体的细胞培养箱中培养24小时至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。 含琼脂培养基凝固后，可用适当的染色方法染色。将供试品、阴性对照、阳性对照小心地放在培养皿的固化琼脂层表面。 每个供试品、阴性对照、阳性对照试样间尽量保持合适的距离并远离培养皿壁，每一培养皿中放置不超过3个试样，每个试样至少设置2个平行。置37℃±1℃含5%±1%CO2的细胞培养箱中至少培养24小时±2小时。用显微镜观察每个供试品、阴性对照、阳性对照试样反应区域。用活体染料，如中性红可有助于检测细胞毒性。 结果评价 按表5进行细胞毒性评价和分级。如阴性对照为0级（无毒）、阳性对照不小于3级（中度毒），则细胞培养试验系统有效。 供试品和/或供试品溶液细胞毒性分级不大于2级（轻度毒）时，则判为合格。 第三法 直接接触法 供试品制备 采用供试品的平整部分，表面积不小于100mm2。 阴性对照制备 取高密度聚乙烯参比物质，照供试品制备项下的规定进行。 阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行。 检查法 取生长旺盛的细胞悬浮液（1×105个/ml）2ml，置直径35mm的平皿中培养单层细胞。置于细胞培养箱中培养24小时至近汇合单层细胞，吸去培养基，替换为0.8ml的新鲜培养基。 在每个培养皿中单独放置1个供试品、阳性对照或阴性对照，每个试样至少设置2个平行。将所有的培养物置37℃±1℃含5%±1%CO2的细胞培养箱中至少培养24小时，培养箱宜保持适当的湿度。显微镜下观察每个供试品、阴性对照、阳性对照周围，必要时应进行染色。 结果评价 按照琼脂扩散法结果评价项下的规定进行。若样品不超过2级（轻度毒），则样品判为合格。若试验系统无效需重复试验过程。 第四法 浸提法 阴性对照制备 取高密度聚乙烯参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。 阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，照供试品溶液制备项下的规定进行。 检查法 取生长旺盛的细胞悬浮液（1×105个/ml）2ml，置直径35mm的平皿中培养单层细胞。培养不少于24小时至细胞至少达到80%近汇合后，吸去培养基，替换为供试品溶液、阴性对照液或阳性对照液。含血清培养基浸提液和不含血清培养基浸提液无需稀释，平行试验2份。0.9%氯化钠注射液为介质的浸提液用含血清的细胞培养基稀释至浸提液浓度为25%，平行试验2份。所有的培养物在37℃±1℃，含5%±1%CO2的培养箱中培养48小时。48小时后，在显微镜下观察培养物，如有必要，进行染色。 结果评价 按表6进行毒性评价和分级。若试验系统不成立，重复试验。供试品不超过2级（轻度毒），则判为合格。如需进行剂量-反应程度评价，可通过定量稀释供试品溶液，重复试验。 |
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