本品系用I型和II型肾综合征出血热（简称出血热）病毒分别接种Vero细胞，经培养、收获、病毒灭活、纯化，混合后加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防I型和II型肾综合征出血热。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为Vero细胞。 2.1.1 细胞管理及检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。各级细胞库细胞代次应不超过批准的限定代次。 每批原液的生产应来自复苏扩增后的同一细胞批。 2.1.2 细胞制备 取工作细胞库的1支或多支细胞，经复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。将复苏后的单层细胞消化，分散成均匀的细胞，加入培养液混合均匀后置适宜温度下培养成单层细胞。 2.2 毒种 2.2.1 名称及来源 生产用毒种为分离自肾综合征出血热病人血清的I型出血热病毒SD9805株和II型出血热病毒HB9908株，或其他经批准的出血热病毒I型和II型毒株。 2.2.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 出血热毒种SD9805株和HB9908株的原始种子均为鼠脑第3代。原始种子毒种经Vero细胞传代分别建立主种子批和工作种子批。I型出血热毒种SD9805株主种子批应不超过第9代，工作种子批应不超过第14代；II型岀血热毒种HB9908株主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第13代。 2.2.3 种子批毒种的检定 主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1~2.2.3.4项检定。 2.2.3.1 鉴别试验 将各型毒种做10倍系列稀释，每个稀释度分别与已知相应型别的出血热病毒免疫血清参考品和阴性兔血清等量混合，分别置37℃水浴90分钟，接种于Vero-E6单层细胞，于37℃培养10~14天，以免疫荧光法测定，中和指数应大于1000。同时设病毒阳性对照、细胞阴性对照。 2.2.3.2 病毒滴定 将各型毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度接种Vero-E6细胞，于33℃培养10~12天，采用免疫荧光法进行测定，病毒滴度均应不低于7.0 lg CCID50/ml。 2.2.3.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 2.2.3.4 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 2.2.3.5 外源病毒因子检查 依法检查（通则3302），应符合规定。 2.2.3.6 免疫原性检查 取主种子批毒种制备双价疫苗，接种2kg左右的白色家兔4只（家兔出血热病毒抗体应为阴性），免疫2次，间隔7天，每只后肢肌内注射1.0ml。第1次免疫后4周釆血分离血清，用蚀斑减少中和试验检测中和抗体，中和用病毒为出血热病毒76-118株和UR株，同时用血清参考品作对照（参考血清应符合规定）。4只家兔的I型和II型出血热中和抗体滴度均应不低于1:10。 2.2.4 毒种保存 冻干毒种应于-20℃以下保存；液体毒种应于-60℃以下保存。 2.3 单价原液 2.3.1 细胞制备 按2.1.2项进行。 2.3.2 培养液 釆用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）。 2.3.3 对照细胞外源病毒因子检查 依法检查（通则3302），应符合规定。 2.3.4 病毒接种和培养 当细胞培养成致密单层后，将出血热病毒I型和II型毒分别接种细胞进行培养，病毒接种量及培养条件按批准的执行。 2.3.5 病毒收获 继续培养一定时间后，收获病毒液。根据细胞生长情况，可换以维持液继续培养，进行多次病毒收获。检定合格的同一细胞批生产的同一次病毒收获液可合并为单次病毒收获液。 2.3.6 单次病毒收获液保存 于2~8℃保存不超过30天。 2.3.7 病毒灭活 病毒收获液加入β-丙内酯灭活病毒，具体工艺参数，包括收获液蛋白质含量和β-丙内酯浓度等按批准的执行。灭活结束后于适宜的温度放置一定时间，以确保β-丙内酯完全水解。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。 2.3.8 病毒灭活验证试验 按灭活后的单次病毒收获液总量的0.1%抽取供试品，透析后接种于Vero-E6细胞，盲传3代，每10~14天传1代，每代以免疫荧光法检查病毒，结果应均为阴性。 2.3.9 合并、超滤浓缩 检定合格的同一细胞批生产的单次病毒收获液可合并为单价病毒收获液，并进行适宜倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。 2.3.10 纯化 采用柱色谱法或其他适宜的方法进行纯化。纯化后取样进行抗原含量及蛋白质含量测定，加入适宜的稳定剂，即为单价原液。 2.3.11 单价原液检定 按3.2项进行。 2.3.12 单价原液保存 于2~8℃条件下保存不超过90天。 2.4 半成品 2.4.1 配制 将I型和II型出血热病毒单价原液分别按抗原含量为1:128稀释后等量混合，且各型总蛋白质含量应不超过40μg/剂，加入适宜稳定剂以及适量硫柳汞抑菌剂和氢氧化铝佐剂后，即为半成品。 2.4.2 半成品检定 按3.3项进行。 2.5 成品 2.5.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.5.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.5.3 规格 每瓶1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml 2.5.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 单次病毒收获液检定 3.1.1 病毒滴定 按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.5 lg CCID50/ml。 3.1.2 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.3 支原体检查 依法检查（通则3301），应符合规定。 3.1.4 抗原含量 采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1:64。 3.2 单价原液检定 3.2.1 蛋白质含量 应不高于160μg/ml（通则0731第二法）。 3.2.2 抗原含量 采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不低于1:512。 3.2.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.4 牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（通则3411）。 3.2.5 Vero细胞DNA残留量 应不高于100pg/剂（通则3407第一法）。 3.2.6 Vero细胞蛋白质残留量 采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于2μg/剂。 3.3 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.4 成品检定 3.4.1 鉴别试验 可选择下列方法进行鉴别试验。 3.4.1.1 效价测定 按2.2.3.6项进行，效价测定符合规定，鉴别试验判为合格。效价测定不合格，采用RT-PCR方法进行鉴别试验。 3.4.1.2 RT-PCR方法 可采用商业试剂盒进行，按试剂盒要求操作。阳性对照为I型和II型阳性质粒，空白对照为无菌（注射用）水。 引物序列为： HTNF1：5'-ATAACAACGATGGCAACTATGGAG-3'； HTNR1：5'-CTCATCTGGATCCTTTTCATATTGT-3'； SEOF1：5'-GCACTGCATGATCGGGAGAGT-3'； SEOR1：5'-ATCCTGTCGGCAAGTTGGC-3'。 探针序列为： HTNP：5'-FAM-ATAGCCAGGCAGAAGG-MGB-3'； SEOP：5'-HEX-TCGCAGCTTCAATACAA-MGB-3'。 样品、阳性对照和空白对照均重复3个孔进行试验。结果判定按试剂盒说明书进行，结果为阳性者，鉴别试验判为合格。 3.4.2 外观 应为微乳白色混悬液体，久置形成可摇散的沉淀，无异物。 3.4.3 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.4.4 渗透压摩尔浓度 依法检查（通则0632），应符合批准的要求。 3.4.5 化学检定 3.4.5.1 pH值 应为7.2~8.0（通则0631）。 3.4.5.2 硫柳汞含量 应不高于50μg/ml（通则3115）。 3.4.5.3 铝含量 应不高于0.6mg/ml（通则3106）勘误应不高于 0.21mg/ml（通则 3106）。 3.4.6 效价测定 按2.2.3.6项进行，4只家兔的I型和II型出血热中和抗体滴度均应不低于1:10。 3.4.7 热稳定性试验 应由生产单位在成品入库前取样测定，于37℃放置7天，按3.4.6项进行效价测定，如合格，视为效价测定合格。 3.4.8 抗生素残留量 生产过程中加入抗生素的应进行该项检查。采用酶联免疫吸附法（通则3429），应不高于50ng/剂。 3.4.9 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.4.10 异常毒性检查 依法检查（通则1141），应符合规定。 3.4.11 细菌内毒素检查 应不高于50EU/剂（通则1143凝胶限度试验）。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为20个月。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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