(酶联免疫吸附法) 本法系采用酶联免疫吸附法检查抗毒素、抗血清制品的蛋白质成分。 试剂 (1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠0.32g、碳酸氢钠0.586g,加水溶解并稀释至200ml。 (2) 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,121℃灭菌15分钟。 (3) 洗涤液(PBS-Tween20) 量取聚山梨酯20 0.5ml,加磷酸盐缓冲液至1000ml。 (4) 封闭液 称取牛血清白蛋白2.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (5) 稀释液 称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (6) 底物缓冲液(0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠0.68g、枸橼酸(C6H8O7?H2O)1.05g,加水溶解并稀释至1000ml,调pH值至3.6。 (7) 底物液A 称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.08g,加二甲基亚砜40ml溶解,加甲醇60ml,混匀,加底物缓冲液100ml,避光搅拌2小时至完全溶解,避光室温静置4小时。 (8) 底物液B 量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml,加底物缓冲液稀释至1000ml。 (9) 底物液 取底物液A、底物液B等体积混匀。临用前配制。 (10) 终止液 2mol/L硫酸溶液。 阴性对照、阳性对照的制备 用马IgG作阳性对照,用人IgG、牛IgG、羊IgG、猪IgG作阴性对照,取阴性对照、阳性对照,用包被液稀释至适宜浓度。 供试品溶液的制备 取供试品适量,用包被液稀释成5~10μg/ml。 测定法 分别以100μl/孔加至酶标板内,供试品溶液及对照溶液均做双孔,用封口膜封好,2~8℃放置16~20小时;用洗涤液洗板3次,用封闭液以200μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次,用稀释液按1∶2000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗马IgG抗体,以100μl/孔加至酶标板内,用封口膜封好,37℃放置1小时;用洗涤液洗板6次,以100μl/孔加入底物液,室温避光放置5~15分钟;以100μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在波长450nm处测定吸光度。 结果判定 取4种阴性对照中吸光度最高的计算Cutoff值,Cutoff值为阴性对照吸光度(2孔平均值)的2.1倍。阳性对照的吸光度大于Cutoff值则试验成立,供试品吸光度大于Cutoff值时为阳性,表示供试品与马IgG同源。 |