（酶联免疫吸附法） 本法系采用酶联免疫吸附法测定无细胞百日咳疫苗有效组分百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）。 试剂 （1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加水溶解，定容至1000ml。 (2) 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，121℃灭菌15分钟。 (3) 洗涤液（PBS-Tween20） 量取聚山梨酯20 （Tween20） 0.5ml，加磷酸盐缓冲液稀释至1000mL。 (4) 封闭液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (5) 稀释液 称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。 (6) 底物缓冲液（0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液） 称取醋酸钠0.68g、枸橼酸（C6H8O7?H2O）1.05g，加水溶解并稀释至1000ml，调pH值至3.6。 (7) 底物液A 称取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）0.08g，加二甲基亚砜40ml溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室温静置4小时后使用。 (8) 底物液B 量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml，加底物缓冲液稀释至1000 ml。 (9) 底物液 取底物液A和底物液B等体积混匀，临用前配制。 (10) 终止液 2mol/L硫酸溶液。 阳性对照的制备 用纯化的PT或FHA参考品作阳性对照（2～8μg/ml）。 阴性对照的制备 用PBS或其他适宜的对照品作阴性对照。 供试品溶液的制备 取疫苗供试品适量，加枸橼酸钠或其他适宜的试剂进行疫苗解吸附处理。 测定法 分别取PT抗体或FHA抗体（2～5μg/ml）适量，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，2～8℃放置16～20小时；用洗涤液洗板3次，以200μl/孔加封闭液至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次，以100μl/孔加入PT或FHA阳性对照和供试品溶液，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次，稀释辣根过氧化物酶标记的PT抗体或FHA抗体至适当浓度，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次，以100μl/孔加入底物液，室温避光放置5～15分钟；以50μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在适宜波长处测定吸光度。 结果判定 Cutoff值为阴性对照吸光度的2.1倍。阳性对照的吸光度应大于Cutoff值。 供试品溶液的吸光度大于Cutoff值者为阳性。 |
医药数据
