本法系依据特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结合，抗体暴露出Fc段补体C1q的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲线，计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数（IFC)，以此测定供试品Fc段生物学活性。 试剂 (1)PBS(pH7.2) 称取无水磷酸氢二钠1.02g、无水磷酸二氢钠0.34g、氯化钠8.77g，加适量水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调pH值至7.2，再加水稀释至l000ml。 (2)钙-镁贮备液 称取氯化钙1.10g、氯化镁5.08g，加水25ml使溶解。 (3)巴比妥-钙镁贮备液 称取氯化钠51.85g、巴比妥钠6.37g，加水1000ml使溶解，加入钙-镁贮备液3.125ml，用1mol/L盐酸溶液调pH值至7.3，再加水稀释至1250ml。除菌过滤后4℃保存备用。 (4)牛白蛋白-巴比妥缓冲液 称取牛血清白蛋白0.15g加入巴比妥-钙镁贮备液20ml中，加水溶解并稀释至100ml。临用前配制。 (5)1.3mg/L糅酸PBS(pH7.2)溶液 A液 称取鞣酸1mg，加PBS(pH7.2)10ml，使溶解。 B液 量取A液0.1ml，加PBS(pH7.2)7.5ml，混匀，即得，临用前配制。 (6)10%氯化铬溶液 称取氯化铬5g，加0.85%~0.90%氯化钠溶液50ml使溶解。4℃保存(可保存半年)。 (7)1%氯化铬溶液 取10%氯化铬溶液0.1ml，加0.85%~0.90%氯化钠溶液0.9ml，混匀。临用前配制。 敏化红细胞的制备 A液 取健康人抗凝的O型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次以每分钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1.3mg/L糅酸PBS(1∶40)，置37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2.5%红细胞悬浮液。 B液 用PBS适当稀释的白喉类毒素或腮腺炎病毒与1%氯化铬溶液0.25ml混合(10∶1)后，置37℃水浴中轻摇15分钟。 将A液、B液按1∶4混合，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至适宜浓度，使其在波长541nm处的吸光度为1.0±0.1。 参考品溶液的制备 用1mol/L氢氧化钠溶液将参考品pH值调节至6.8~7.0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。 供试品溶液的制备 用1mol/L氢氧化钠溶液将供试品pH值调至6.8~7.0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每1ml含40mg。 测定法 取供试品溶液0.9ml，加敏化红细胞悬液0.1ml，混匀，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白-巴比妥缓冲液1ml洗涤红细胞，共洗3次。末次离心后弃上清液800μl，向沉淀中加入600μl预热到37℃的牛白蛋白-巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每1ml含150CH50的补体200μl，混匀后立即照紫外-可见分光光度法(通则0401)在波长541nm处测定起始吸光度(As)，之后，每隔1分钟测定1次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。分别取参考品及阴性对照(牛白蛋白-巴比妥缓冲液)0.9ml，自“加敏化红细胞悬液0.1ml”起，同法操作。按公式(1)分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IFC)，应不低于国家参考品活性的60%。 式中S'为用As修正Sexp得到的曲线斜率； As分别为供试品、参考品、阴性对照在波长541nm处测定的起始吸光度； Sexp分别为根据供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出的相邻3点间的曲线最大斜率； IFC为供试品激活补体的功能指数； S's为供试品曲线斜率； S'r为参考品曲线斜率； S'c为阴性对照曲线斜率。 |
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