分子式：C257H383N65O77S6 分子量：5807.69Da 本品系由含有可高效表达人胰岛素基因的工程化细胞，经发酵、分离、高度纯化、结晶和干燥制成的原料药。人胰岛素为51个氨基酸残基组成的蛋白质。按干燥品计算，含人胰岛素（包括A21脱氨人胰岛素）应为95.0%～105.0%。 每1单位人胰岛素相当于0.0347mg。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌 工程菌菌种名称、来源及种子批检定应符合批准的要求。 2.2 原料 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批细胞接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 应根据经批准的工艺进行发酵，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。如系大肠埃希菌表达，发酵液应定期进行质粒丢失率检查(通则3406)。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集、处理细胞。 2.2.5 初步纯化及高度纯化 釆用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6 过滤、结晶及干燥 经初步纯化和高度纯化后，釆用经批准的结晶工艺及干燥工艺对纯化收集物进行过滤、结晶和干燥，干燥品即为人胰岛素原料药。 2.2.7 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.2.8 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 3 检定 3.1 性状 本品为白色或类白色粉末。 3.2 鉴别 3.2.1 在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。 3.2.2 取本品适量，用0.1%三氟乙酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）20μl、0.1%V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（90∶10）为流动相A、乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，片段Ⅱ与片段Ⅲ之间的分离度应不小于3.4，片段Ⅱ与片段Ⅲ的拖尾因子应不大于1.5。供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。 3.3 检查 3.3.1 有关物质 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。照含量测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（82∶18）为流动相A、乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。调节流动相比例使人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适用性试验应符合含量测定项下的规定。取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，A21脱氨人胰岛素不得过1.5%；其他杂质峰面积之和不得过2.0%。 3.3.2 高分子蛋白质 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法（通则0514）试验。以亲水改性硅胶为填充剂（5～10μm）；以冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65）为流动相，流速为每分钟0.5ml，检测波长为276nm。取人胰岛素单体-二聚体对照品，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中含4mg的溶液；取100μl注入液相色谱仪，人胰岛素单体峰与二聚体峰的分离度应符合要求。取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，除去保留时间大于人胰岛素主峰的其他峰面积；按峰面积归一化法计算，保留时间小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得大于1.0%。 3.3.3 锌 精密称取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液。另精密量取锌单元素标准溶液（每1ml中含锌1000μg）适量，用0.01mol/L的盐酸溶液分别定量稀释成每1ml含锌0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg及1.0μg的锌标准溶液，照原子吸收分光光度法（通则0406第一法），在213.9nm的波长处分别测定吸光度，按干燥品计，含锌量不得大于1.0%。 3.3.4 干燥失重 取本品0.2g，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过10.0%（通则0831）。 3.3.5 炽灼残渣 取本品约0.2g，依法检查（通则0841），遗留残渣不得过2.0%。 3.3.6 微生物限度 取本品0.3g，照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105），每1g供试品中需氧菌总数不得过300cfu。 3.3.7 细菌内毒素 取本品，依法检查（通则1143），每1mg人胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。 3.3.8 宿主蛋白残留量 取本品适量，依法检查（通则3412或3414），或釆用经验证并批准的适宜方法检查，每1mg人胰岛素中宿主蛋白残留量不得过10ng。 3.3.9 宿主DNA残留量 取本品适量，依法检查（通则3407），或采用经验证并批准的适宜方法检查，每1.5mg人胰岛素中宿主DNA残留量不得过10ng。 3.3.10 抗生素残留量 如生产（例如种子液制备）中使用抗生素，应依法检查（通则3408），或釆用经批准的方法检查，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.3.11 生物学活性（至少每年测定一次） 取本品适量，照胰岛素生物测定法（通则1211），每组的实验动物数可减半，实验釆用随机设计，照生物检定统计法（通则1431）中量反应平行线测定随机设计法计算效价，每1mg人胰岛素的效价不得少于15单位。 3.3.12 N末端氨基酸序列（至少每年测定一次） 取本品，采用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定。 A链N末端15个氨基酸序列： Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln； B链N末端15个氨基酸序列： Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。 3.3.13 单链前体 工艺中如有单链前体，应采用经批准的方法及限度进行控制。 3.4 含量测定 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5～10μm），0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（74∶26，或适宜比例）为流动相；流速为1.0ml/min；柱温40℃；检测波长为214nm。取系统适用性试验用溶液（取人胰岛素对照品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含1mg的溶液，室温放置至少24小时）20μl，注入液相色谱仪，人胰岛素峰和A21脱氨人胰岛素峰（与人胰岛素峰的相对保留时间约为1.3）的分离度不小于1.8、拖尾因子不大于1.8。 测定法 取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至每1ml中约含0.35mg（约10单位）的溶液（临用新配）。精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰与A21脱氨人胰岛素峰面积之和计算，即得。 4 保存、运输及有效期 避光，密闭，在－15℃及以下保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 |
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