本品系由高效表达人表皮生长因子基因的酵母，经发酵、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含抑菌剂和抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程菌菌种 2.1.1 名称及来源 人表皮生长因子工程菌株，系由带有人工合成的人表皮生长因子基因的DNA片段整合到酵母菌染色体基因组中构建而成。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1 划种BMG1琼脂平板 应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 染色镜检 在光学显微镜下观察，应形状规则，用次甲蓝染色，无死亡细胞。 2.1.3.3 筛选标志检查 应符合该基因表型特征。 2.1.3.4 人表皮生长因子表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.5 人表皮生长因子基因稳定性检查 涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95%。 2.2 原液 2.2.1 种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养，供发酵罐接种用。 2.2.2 发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。 2.2.3 种子液接种及发酵培养 2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。 2.2.3.2 在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。 2.2.4 发酵液处理 用适宜的方法收集上清液。 2.2.5 纯化 采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为人表皮生长因子原液。如需存放，应规定时间和温度。 2.2.6 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。 原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，应立即分装或保存于2～8℃。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.3 规格 21000IU（5ml）/瓶勘误20000IU（40μg）/2ml/支；30000IU（60μg）/3ml/支；40000IU（80μg）/4ml/支。同品种用于眼内注射、眼内插入、外科手术和急救时，均不得添加抑菌剂或抗氧剂或不适当的缓冲剂，且应包装于无菌容器内供一次性使用。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”和通则0105的有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 生物学活性 依法测定（通则3528）。 3.1.2 蛋白质含量 依法测定（通则0731第二法）。 3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×105IU。 3.1.4 纯度 3.1.4.1 电泳法 依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2 高效液相色谱法 依法测定（通则0512）。色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A（三氟乙酸-水溶液：取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B（三氟乙酸-乙腈溶液：取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22%～37%流动相B）；上样量应不低于5μg，在波长280nm处检测。以人表皮生长因子色谱峰计算理论板数，应不低于500；按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5 分子量 依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15.0%，加样量应不低于1.0μg，供试品的分子质量应为5.90kD±0.59kD。 3.1.6 外源性DNA残留量 每100μg蛋白质应不高于10ng（通则3407）。 3.1.7 宿主菌蛋白质残留量 应不高于总蛋白质的0.1%（通则3414）。 3.1.8 甲醇含量 甲醇含量应不高于0.002%（通则0521）。 3.1.9 等电点 主区带应为4.0～5.0（通则0541第六法）。 3.1.10 紫外光谱 最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。 3.1.11 肽图（至少每半年测定1次） 依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。 3.1.12 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为： Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。 3.1.13 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.2 半成品检定 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.3 成品检定 3.3.1 鉴别试验 按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为无色澄清液体。 3.3.2.2 可见异物 依法检查（通则0904），应符合规定。 3.3.2.3 装量 依法检查（通则0942），应符合规定。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 pH值 应为6.9～7.3（通则0631）。 3.3.3.2 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.4 生物学活性 应为标示量的70%～200%（通则3528）。 3.3.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 4 保存、运输及有效期 于4～25℃避光保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。 5 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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