本品系由无细胞百日咳疫苗原液、白喉类毒素原液及破伤风类毒素原液加入氢氧化铝佐剂制成。用于预防百日咳、白喉、破伤风。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 混合前单价原液 2.1.1 无细胞百日咳疫苗原液制造应符合本品种附录的规定。 2.1.2 白喉类毒素原液制造应符合“吸附白喉疫苗”中2.1~2.2项的规定。 2.1.3 破伤风类毒素原液制造应符合“吸附破伤风疫苗”中2.1~2.2项的规定。 2.1.4 原液检定 2.1.4.1 百日咳疫苗原液检定 按本品种附录中2项进行。 2.1.4.2 白喉类毒素原液检定 按“吸附白喉疫苗”中3.1项进行。 2.1.4.3 破伤风类毒素原液检定 按“吸附破伤风疫苗”中3.1项进行。 2.2 半成品 2.2.1 佐剂配制 佐剂的制备和检定（通则3650）应符合批准的要求。 2.2.2 合并及稀释 将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液加入已稀释的佐剂内，调pH值至5.8~7.2，使每1ml半成品含无细胞百日咳疫苗原液应不高于18μgPN；白喉类毒素应不高于25Lf；破伤风类毒素应不高于7Lf。 2.2.3 半成品检定 按3.1项进行。 2.3 成品 2.3.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.3.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.3.3 规格 每瓶0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml。每1次人用剂量0.5ml，含无细胞百日咳疫苗效价应不低于4.0IU，白喉疫苗效价应不低于30IU，破伤风疫苗效价应不低于40IU。 2.3.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 半成品检定 3.1.1 无菌试验 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.1.2 吸附率检查 将供试品离心取上清液，同时取供试品进行适当稀释，选取0~100μg/ml范围作为对照品溶液浓度，依法测定[通则0731第二法福林酚法（Lowry法）方法2]供试品及其上清液的蛋白含量，再按下式计算吸附率，应不低于95%。 式中 P为吸附率，%; cs为供试品上清液的蛋白含量，μg/ml； ct为供试品的蛋白含量，μg/ml。 3.2 成品检定 3.2.1 鉴别试验 3.2.1.1 无细胞百日咳疫苗 可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物应产生抗体（按3.2.4.1项进行）；（2）采用酶联免疫吸附法检测PT、FHA抗原，应含有相应抗原（通则3417）；（3）其他适宜的抗原抗体反应试验。 3.2.1.2 白喉类毒素 可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物应产生抗体（通则3505）；（2）疫苗加枸椽酸钠或碳酸钠将佐剂溶解后，做絮状试验（通则3506），应岀现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），应出现免疫沉淀反应。 3.2.1.3 破伤风类毒素 可选择下列一种方法进行：（1）疫苗注射动物后应产生破伤风抗体（通则3504）；（2）疫苗加入枸椽酸钠或碳酸钠将吸附剂溶解后做絮状试验（通则3506），应出现絮状反应；（3）疫苗经解聚液溶解佐剂后取上清液，做凝胶免疫沉淀试验（通则3403），出现免疫沉淀反应。 3.2.2 物理检查 3.2.2.1 外观 振摇后应呈均匀乳白色混悬液，无摇不散的凝块或异物。 3.2.2.2 装量 依法检查（通则0102），应不低于标示量。 3.2.2.3 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.2.3 化学检定 3.2.3.1 pH值 应为5.8~7.2（通则0631）。 3.2.3.2 铝含量 应为0.17~0.26mg/剂（通则3106）。 3.2.3.3 硫柳汞含量 应不高于0.05mg/剂（通则3115）。 3.2.3.4 游离甲醛含量 应不高于0.1mg/剂（通则3207第一法）。 3.2.3.5 戊二醛含量 应小于0.005mg/剂（通则3204）。 3.2.4 效价测定 3.2.4.1 无细胞百日咳疫苗 按“吸附百白破联合疫苗”中附录2进行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU，且95%可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有的有效试验结果必须以几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均）来计算。达到上述要求即判为合格。 3.2.4.2 白喉疫苗 每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU（通则3505）。 3.2.4.3 破伤风疫苗 每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU（通则3504）。 3.2.5 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 3.2.6 特异性毒性检查 3.2.6.1 无细胞百日咳疫苗 按本品种附录中2.5项进行。 3.2.6.2 白喉、破伤风疫苗 用体重250~350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两侧注射，每侧1.25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。 3.2.7 毒性逆转试验 每批供试品置37℃ 4周，按本品种附录中2.6项进行。 3.2.8 细菌内毒素检查 每1次人用剂量应不高于100EU（通则1143）。 4 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为24个月；自百日咳原液脱毒之日起，疫苗总有效期不得超过36个月。 5 附录 无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求。 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 附录 无细胞百日咳疫苗原液制造及检定要求 本品系由百日咳杆菌的培养物或其上清液，经硫酸铵盐析和蔗糖密度梯度离心法提取百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）等有效组分，经脱毒制成。用于制备吸附无细胞百白破联合疫苗。 1 制造 1.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 1.1.1 名称及来源 生产用菌种应采用百日咳I相CMCC 58003（CS株）或其他适宜菌株。 1.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的规定。 1.1.3 种子批的传代 工作种子批菌种启开后传代不应超过10代用于生产。 1.1.4 种子批的检定 1.1.4.1 培养特性 于包-姜（Bordet-Gengou）培养基或其他适宜培养基上培养，各菌株应具有典型的形态，葡萄糖、尿素酶、硝酸盐、枸椽酸盐、半固体（动力）营养琼脂结果均应为阴性。 1.1.4.2 血清学试验 取经35~37℃培养40~48小时的菌苔，混悬于0.85%~0.90%氯化钠溶液或PBS内，制成适宜浓度的菌悬液，与I相参考血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。并同时进行Fim2、Fim3的血清学检测，应为阳性。 1.1.4.3 皮肤坏死试验 取经35~37℃培养40~48小时的菌苔，混悬于PBS内，并稀释成不同浓度的菌液；取家兔或豚鼠至少2只，分别用每一稀释度的菌液皮内注射0.1ml，经72小时观察注射部位的皮肤反应，其中至少1只家兔或豚鼠在注射含菌4.0×107以下稀释度的部位出现出血性坏死者，为阳性反应，判为合格。 1.1.4.4 毒力试验 用体重16~18g的小鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培养20~24小时、以PBS稀释的菌液0.05ml，观察14天，记录小鼠生死情况，按Reed-Muench法计算LD50，1LD50的菌数应不高于1.2×108。 1.1.4.5 效价测定 按“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。 1.1.5 菌种保存 种子批应冻干保存于8℃及以下。 1.2 原液 1.2.1 生产用种子 将工作种子批菌种启开后，接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基或其他适宜培养基上，于35~37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时。传代菌种保存不得超过14天，工作种子批启开后用于生产时不应超过10代。 1.2.2 生产用培养基 应选用S-S（Stainer-Scholte）培养基或其他适宜培养基。 1.2.3 培养 可采用静置培养法或发酵罐培养法，培养过程应取样做纯菌检查。 1.2.4 收获和杀菌 培养物于对数生长期后期或静止期前期收获。在培养物中加入硫柳汞杀菌。 1.2.5 纯化 采用硫酸铵盐析和蔗糖密度梯度离心，收集PT、FHA有效组分。 1.2.6 蛋白氮含量测定 依法测定（通则0731第二法）。 1.2.7 纯度测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，应显示主要含有PT和FHA两种组分，且批间比例应保持一致。PT和FHA等有效组分应不低于总蛋白质含量的85%。 1.2.8 脱毒和匀化 采用甲醛溶液或戊二醛溶液脱毒，然后用适宜方法除去脱毒剂，再经超声波匀化处理即为原液。 2 检定 2.1 染色镜检 取供试品的沉淀物，涂片染色镜检，不应有百日咳杆菌和其他细菌。 2.2 效价测定 按“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。即先将原液稀释至成品的浓度后，以适宜的稀释倍数为第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释，免疫21天后攻击。 2.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 2.4 不耐热毒素试验 用0.85%~0.90%氯化钠溶液将供试品稀释至半成品浓度的2倍，用48~72小时龄的乳鼠至少4只，每只皮内注射0.025ml，或用体重2.5kg的家兔至少2只，每只皮内注射0.1ml，观察4日，受试动物不得出现不耐热毒素引起的任何局部反应。 2.5 特异性毒性检查 毒性参考品按照每批标示进行稀释，将供试品稀释至与成品相同浓度。用体重14~16g NIH小鼠（雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行2.5.1~2.5.3项试验。 2.5.1 小鼠白细胞增多试验 于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。 2.5.2 小鼠组胺致敏试验 于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液（含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg），30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。 2.6 毒性逆转试验 每批供试品置37℃ 4周，然后按2.5.2项进行试验。 2.7 热原检查 用0.85%~0.90%氯化钠溶液将供试品稀释成半成品浓度的1/50，依法检查（通则1142），注射剂量按家兔体重每1kg注射1ml，应符合规定。 3 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自原液脱毒之日起，疫苗总有效期为36个月。 |
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