（细胞增殖法/MTT比色法） 本法系依据人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测人表皮生长因子的生物学活性。 试剂 (1)RPMI 1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。 (2)维持培养液 量取新生牛血清4ml，加RPMI1640培养液至1000ml。 (3)完全培养液 量取新生牛血清100ml，加RPMI1640培养液至1000ml。 (4)PBS 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。 (5)噻唑蓝(MTT)溶液 称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。 标准品溶液的制备 取人表皮生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。 测定法 BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~5.0×105个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×104~8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果： 式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml； Ds为供试品预稀释倍数； Dr为标准品预稀释倍数； Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er为标准品半效量的稀释倍数。 注：显色方法也可以采用经等效验证的其他显色方法。 |
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