1 概述 人用基因治疗制品通常由含有工程化基因构建体的载体或递送系统组成，其活性成分可为DNA、RNA、基因改造的病毒、细菌或细胞，通过将外源基因导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正特定基因，以达到治疗疾病的目的。 依据载体的不同，可将人用基因治疗制品分为以病毒为载体的人用基因治疗制品，以质粒DNA为载体的人用基因治疗制品，以及以细菌为载体的人用基因治疗制品等，其中以病毒和质粒DNA为载体的人用基因治疗制品为常见。 本总论是对人用基因治疗制品生产和质量控制的通用性技术要求，重点针对以病毒和质粒DNA为载体的基因治疗制品，用于基因修饰细胞（在输入受试者或病人之前用基因治疗载体进行离体或体外修饰的自体或异体体细胞）的载体也适用于本总论，具体品种还应结合制品本身的特性制定相关要求。 2 制造 2.1 基本要求 人用基因治疗制品的制造主要包括生产用起始原材料、原材料和辅料的控制，载体的制备，目标成分的提取、纯化和制剂等过程。生产过程中使用的菌毒种和动物细胞基质应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。使用的原材料和辅料应符合“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”的相关要求。应采用经过验证的生产工艺进行生产，并对生产工艺全过程进行控制。 2.2 载体的设计与构建 应基于制品的临床有效性和安全性进行载体的设计与构建。通常基于基因治疗制品的作用机制，如通过编码功能性蛋白质的转基因表达，或采用RNA干扰、小RNA或基因编辑等方式，采用基因沉默、外显子跳跃、基因调控或基因敲除等方式修复、添加或删除特定的基因序列，进行载体的设计与构建。 基因治疗制品中使用的载体可以设计为靶向特定组织或细胞，或删除与毒力、致病性或复制能力相关基因的病毒，以确保制品的安全性。 用于基因治疗制品的常见的载体系统是病毒载体和质粒DNA载体。病毒载体可分为非复制型、条件复制型或复制型，每种类型在设计时都应针对安全性方面进行特别考虑。采用非复制型载体要选择尽可能少产生复制活性病毒或能够有效避免辅助病毒风险的方法。质粒DNA载体应考虑抗生素抗性基因可能给病人带来的风险和危害，且不得使用氨苄西林抗性基因。 2.3 起始原材料 用于基因治疗制品生产的起始原材料主要包括生产用细胞、细菌或病毒种子。用于生产的细胞、细菌或病毒种子的来源和历史应清晰，应建立至少两级细胞库和/或细菌/病毒种子批系统。 应对所有起始原材料进行充分鉴定并建立明确的质量控制要求，确保无细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染。应保证起始原材料的遗传稳定性，并基于细胞库/种子批经长时间培养或多次传代后产物的完整性和一致性，以及其表型和基因型特征等确定生产用细胞库/种子批的最高限度代次。 以下是对生产用起始原材料质量控制的一般要求，对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况考虑。 2.3.1 病毒种子批 病毒种子批质控项目的确定应根据种子批建立的特定情况以及病毒种子本身的相关特征，基于风险分析进行评估。主种子批的质控项目通常包括鉴别（基因扩增、限制性内切酶酶切图谱和免疫血清学检测等）、病毒滴度、治疗序列的转录/表达（如适用）、治疗序列或表达产物的生物活性（如适用）、无菌检查（细菌和真菌）、支原体检查、外源病毒因子检查、复制型病毒（制品本身为复制缺陷型或条件复制型）等。主种子批确定无外源因子污染时，其工作种子批只需检测该制备过程中可能引入的外源因子污染；如因主种子批数量限制而无法进行全面的外源因子检查时，应对工作种子批进行全面检定。外源病毒因子应符合“外源病毒因子检查法”的相关要求，同时还应对种子批历史传代过程中可能污染的特定外源病毒因子进行检测。除另有规定外，应对病毒基因组的完整序列进行分析，或至少应确认重要区域（如治疗和调控元件，以及被人为修改的任何区域及其侧翼至少0.5kb内的区域）的序列与理论预期相符。在特定情况下因某些位点产生突变造成序列与理论不符，应提供不影响目的基因表达和制品质量的证据。应证明生产用病毒种子批的遗传稳定性、目的基因表达稳定性和生产稳定性。 2.3.2 生产/包装细胞库 生产/包装细胞系进行的检测应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求，通常包括鉴别及纯度、基因分型/表型、遗传稳定性等，另外，在适用的情况下还应检测成瘤性/致癌性、引入序列的鉴别和完整性以及拷贝数等。 生产/包装细胞库内、外源病毒因子检查应按本版药典相关通则进行。应确定无细菌、真菌、支原体和螺原体（昆虫细胞）等污染。 2.3.3 细菌种子批 细菌种子批的质控项目通常包括菌落形态、染色镜检、生化特性、抗生素抗性检查、电镜检查、质粒限制性内切酶酶切图谱分析等。应确保不存在其他细菌、真菌和噬菌体的污染。应检测细菌种子批多次传代后的基因型和表型的稳定性。此外，对于基因修饰的细菌，其基因组重要区域（如引入的治疗和调控元件，以及被人为改造的任何区域及其侧翼至少0.5kb内的区域）的序列应与理论预期相符。在特定情况下因某些位点产生突变造成序列与理论不符时，应提供不影响目的基因表达和制品质量的证据。对于经基因改造的质粒不大于50kb的，应进行全序列测定。对于转导质粒的细菌种子批，应检测质粒拷贝数和有/无质粒细菌的比例。对于生产质粒用途的细菌种子批，应检查质粒产率。对于引入的治疗基因，应检测其表达水平和功能活性。对于减毒细菌载体，应鉴定其减毒的特性和稳定性，并检测其对抗生素的敏感性。 2.3.4 质粒DNA 对用于瞬时共转染生产过程的质粒DNA，需对其来源、特性、分离纯化方法以及核酸序列等进行描述，对质粒DNA的复制起始点、启动子以及编码选择性标记的基因等组成元件的来源和功能进行说明。质粒的生产应基于细菌种子批系统，并符合相关要求。应采用适宜的方法纯化质粒，并基于风险分析和产品特性对每批质粒的质量进行检测，通常包括鉴别、基因组完整性、质粒含量、质粒纯度、宿主细胞DNA残留量、质粒对细胞的转染效率或其他可反映转染效率的检测项目，如细菌内毒素检查和无菌检查等，检测结果符合要求后才能用于载体的生产。 2.4 原材料及辅料 生产过程中所使用的原材料及辅料应符合“生物制品生产用原材料及辅料质量控制”的相关要求。对可能影响制品安全性的相关原材料(或诸如辅助病毒/包装序列或介质等原材料的组成部分)，应评估其在最终制品或工艺最适阶段中的残留情况，并根据具体情况确定其残留限度。 辅助病毒涉及病毒种子批系统的设计、构建、生产和使用等应符合2.3.1项相关要求。 来源于动物组织或体液的原材料应严格控制外源因子污染的安全性风险。生产过程中不得使用青霉素等β-内酰胺类抗生素和链霉素，以及其他如溴化乙锭等有毒试剂。 用作病毒或DNA载体递送系统的复合材料必须符合其预期目的，并具有良好的工艺稳定性和产品稳定性。应根据其具体性质和对制品的影响情况进行适当鉴定，并建立相应的检测方法和质控要求。 2.5 生产过程的控制 生产工艺应稳定可靠，并有明确的过程控制参数，以确保制品安全、有效和全程质量可控。生产工艺的确定应建立在对目标制品的质量属性、生产工艺的深入理解和全面设计基础上。应根据研发早期到规模化生产的整个工艺周期的相关信息，确定原液和成品生产的关键步骤，并依据制品的关键质量属性，确定工艺参数和过程控制项目，并制定相应可接受标准进行控制，以确保工艺过程的重现性及制品质量的批间一致性。 2.5.1 病毒/细菌培养物的制备 2.5.1.1 病毒培养物的制备 (1) 细胞培养 将工作细胞库细胞按规定传代，同一种病毒生产用的细胞扩增应尽可能按相同的消化程序、分种扩增比率、培养时间及培养条件进行传代。在病毒种子或产品的外源病毒因子检查因制品病毒不能被充分中和而受到干扰等情况下，应在生产中设置对照细胞，对照细胞的外源病毒因子检查应符合本版药典的要求。采用生物反应器微载体培养的应按固定的放大模式扩增，并建立与生物反应器培养相适应的对照细胞外源因子检查。细胞培养过程中需监测细胞的生长状况，并根据生产系统的特点确定监测频率及指标。 (2) 病毒增殖和收获 接种病毒时应明确病毒感染性滴度与细胞的最适比例，同一工作种子批按同一MOI接种。采用多质粒瞬时转染或加入辅助病毒等生产病毒的方式，也应明确加入量与细胞的最适比例。 应根据生产过程中培养、增殖和产物产量一致性的研究资料，确定终止培养、收获产物的技术参数。每次收获后应检测目标产物含量、细菌内毒素、支原体等。应根据生产过程及所用材料的特点，在适宜的阶段进行常规或特定的外源病毒污染检查。 来源于同一细胞批的单次病毒收获液经检验合格可合并进行纯化。多次收获的病毒培养液，如单一培养容器出现污染，则与该污染容器相关的病毒收获液均不得用于生产。 2.5.1.2 细菌培养物的制备 (1) 细菌培养 将工作种子接种于规定的培养基进行培养扩增。自菌种开启到菌体收获应有明确的扩增次数规定。细菌培养过程中可进行细菌纯度、细菌总数、pH值及耗氧量等监测。 (2) 菌体的收获 根据不同的培养方式采用适宜的方法收获菌体。培养物收获后应进行细菌纯度、细菌总数、活菌含量等检测。 2.5.2 提取和纯化 采用的分离纯化方法或技术，应能适应于规模化生产并保持稳定。应对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格控制，包括固定相或流动相中的化学试剂、各类亲和色谱柱的脱落配基或抗体以及可能对目标制品关键质量属性造成影响的各种物质等。 纯化工艺应保证将制品的一些特定工艺杂质去除或降低至可接受的水平，包括来自表达载体的核酸、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、污染的外源因子、细菌内毒素、核酸酶以及源自培养液的各种其他残留物等。 2.5.3 原液 收获液经提取、纯化后分装于中间贮存容器中即为原液。如需加入稳定剂或赋形剂，应不影响质量检定，否则应在添加辅料前取样进行原液检定。原液的检测项目取决于工艺的验证、一致性的确认以及预期的制品相关杂质与工艺相关杂质水平。应采用适当方法对原液质量进行检测，必要时应与标准物质进行比较。原液如需贮存，应通过制品稳定性验证确定贮存条件和时间。 2.5.4 复合工艺控制 对于复合的基因治疗制品（如载体或基因构建体与高分子聚合物、聚阳离子、纳米材料、脂质、蛋白质等形成复合物或相连接），其复合材料的生产以及复合的过程应根据具体的产品情况和工艺特点设置适宜的工艺参数和过程控制要求，以保持工艺稳定性和产品质量的一致性。 2.5.5 半成品 除另有规定外，制备成品前，如需对原液进行稀释或加入其他辅料制成半成品，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受的标准。 2.5.6 成品制剂 制剂生产应符合本版药典和中国现行《药品生产质量管理规范》的相关要求。 2.5.7 包装及密闭容器系统 直接应用于人体的基因治疗制品原液和成品与容器的相容性应符合相关要求。此外，应采用适宜方法对容器完整性进行检测，防止容器泄漏导致制品无菌状态的破坏。 2.6 生产工艺变更 生产工艺变更应符合国家药品注册管理等相关要求。涉及重大生产工艺的变更，应对变更前后的制品质量、安全性和有效性进行比较和评估，以证明变更前后制品特性的高度相似，并确保任何质量属性方面的改变对制品安全和有效性无负面影响。 3 特性分析 应采用先进的分析手段，从生物学、分子生物学、免疫学、物理化学等角度，对人用基因治疗制品的基因型和表型、纯度、治疗序列活性/生物效价、感染性/转导效率和预期用途的适用性等进行全面的分析，并提供尽可能详细的信息，以反映目标制品内在的质量属性，并作为建立和制定上市制品质量标准的基础。特性分析应包括对原材料、中间体、原液和成品特性的分析。对于复合核酸载体，应充分研究载体、复合组分和复合物的特性。特性分析数据可能来自整个开发和（或）制造过程。对于不同阶段（开发、试生产、完整规模生产等）生产的产品批次可根据不同情况开展适宜程度的特性分析研究，其中用于制定上市制品质量标准的产品批次工艺应代表预期的上市制品工艺。 特性分析一般在研发阶段进行，并通过生产工艺的优化，以及具有代表性的足够批次制品的周期性监测加以完善。 特性分析至少应包括以下内容。 3.1 结构分析 应对治疗序列的选择/调节/控制作用涉及的基因完整序列进行分析，并进行适宜的限制性内切酶酶切图谱分析，以补充鉴定转录/翻译元件和开放阅读框以及其余载体序列。应检测重组载体基因组或质粒的完整性和均一性，进行载体递送的治疗序列和选择/调节元件的表型鉴别和分析。对于病毒载体，适当情况下应测定插入位点，并充分评估插入突变的可能性和相关风险；对于质粒，应确认复制起点的位置以及是否存在CpG序列（如果与制品的设计相关）；对于细菌载体，应确认是否存在涉及制品安全性的插入/删除序列；对于转导的细菌载体，应检测质粒和相关调控/控制元件的存在及序列。 3.2 生物学活性 应依据制品的作用机制，尽可能确定与疗效最为相关的质量属性，并建立相应的检测方法。应证明替代、补偿、阻断、修正特定基因的预期作用，对于含有多种活性成分的制品，需要分别建立方法对各个成分的活性进行测定，同时还应考虑活性成分之间可能存在的干扰或协同等作用。在相关细胞类型中分析载体的转导效率和/或拷贝数、转基因表达水平、相关生物活性以及与载体或递送系统的作用机制相关的因素。应分析预期的病毒载体的宿主范围和组织嗜性，或复合核酸递送的选择性，以及转基因表达的选择性。 3.3 纯度、杂质和污染物 人用基因治疗制品杂质主要包括工艺相关杂质、制品相关杂质以及外源污染物。应尽可能地对杂质进行分析鉴定，并采用适宜的方法评估其对生物学活性和安全性的影响。在复合核酸的情况下，应考虑到复合物合成和生产所产生的副产品/杂质对复合物的安全性和性能的影响。 3.3.1 工艺相关杂质 工艺相关杂质来源于生产工艺本身，主要包括起始原材料来源（如残留宿主细胞DNA和残留宿主细胞蛋白质等）、原材料来源（如培养试剂、纯化试剂、辅助病毒和辅助病毒核酸等）和设备材料来源（如工艺中的可浸出物和可提取物、色谱填料脱落物等）的杂质，应对潜在的工艺相关杂质进行鉴定、评估，并进行定性和/或定量分析。 3.3.2 制品相关杂质 应尽可能鉴定具有缺失、重排、杂交或突变序列的载体等制品相关杂质，如可行，应对其进行定量。必要时，应对载体中可能存在的共包装非目标DNA序列进行确认。应分析生产过程中潜在的载体降解情况，如测定非感染性载体、转导效率降低的质粒，或核酸复合物经过氧化或解聚等的降解形式。在设计为复制缺陷型或条件复制型载体的情况下，应分析是否存在残留的复制型或野生型载体及其水平。 3.3.3 污染物 污染物系指所有引入且并非生产过程所需的物质（如各种微生物、细菌内毒素）。应严格避免引入污染物并对其进行相应控制。 3.4 含量 应建立基因治疗制品物理数量和生物数量的含量检测指标。可以通过诸如总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组DNA/RNA或质粒DNA浓度等的检测来确定含量。可通过物理、生物物理等方法来测量颗粒的物理数量，或测量病毒颗粒内已知分子量和拷贝数的某种代表性的结构蛋白来评估病毒颗粒数。感染性滴度或感染性颗粒数可采用噬斑形成单位（PFU）、半数组织培养感染剂量（TCID50）等基于细胞的体外检测方法。对于病毒载体，应控制总颗粒数或基因组拷贝数等物理数量与感染性滴度或感染性颗粒数的比例。应尽可能使用标准品或对照品来校准含量测定结果。通过方法学研究确定用于制品放行检定的含量测定方法。 3.5 其他特性 通常应评估颗粒或分子大小的平均值和分布、聚集体以及折射率等多种理化和其他特性及其与制品安全、有效性的关系，必要时应将其纳入制品检定项目中。 病毒载体类基因治疗制品，还应对病毒的感染性、毒力、复制能力等特性进行分析。应分析载体脱落、载体复制、插入突变、内源性病毒再激活或与内源性病毒互补的可能性，以及对安全性的影响。 复合核酸类基因治疗制品，其复合物的结构以及载体和带负电荷的DNA之间的相互作用可能影响制品的安全性和有效性，应充分鉴定复合/递送系统的性质，包括结构形式、粒度分布、表面电荷、在特定情况和生物环境中的稳定性，以及复合结构内的核酸分布。通过特性研究确定的与关键质量属性相关的特性，如对预期用途有重要影响的复合核酸的生物化学和生物学特性，应建立适宜的方法并纳入制品放行检定项目。 细菌载体类基因治疗制品，应测定其质粒拷贝数和含/不含质粒细菌的比例。应分析表型、免疫学特性（包括遗传修饰的细菌成分）以及由细菌载体递送的治疗序列和选择/调控元件等。 4 标准物质 对于效价、感染性滴度等活性检测方法，应建立具有长期稳定性的活性标准品/参考品。对于鉴别试验、颗粒数等各种理化分析，可选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个（多个）批次，或用一个代表批次作为参考品/对照品，并应按特性分析要求进行分析鉴定。在采用PCR或定量PCR方法的检定项目中所用到的质粒DNA或核酸对照品，在制备和分装后应进行适宜的分析鉴定。 标准品/参考品/对照品的建立和制备可参照“生物制品国家标准物质制备和标定'的相关要求。 5 制品检定 应根据制品关键质量属性、对制品和工艺的深入了解和风险评估的原则，制定相应质量控制策略。制品检定采用的检测方法应经验证或确认并符合要求。纳入质量标准的检定项目、可接受限度，应结合特性分析数据、临床前和（或）临床研究多批次样品的数据、工艺验证批次的数据、稳定性研究数据等综合确定。基因治疗制品的质量检定至少应包括以下项目，但对不同的制品和生产工艺还需结合具体情况加以考虑。 5.1 鉴别试验 根据人用基因治疗制品的情况，应在核酸序列水平采用限制性内切酶酶切图谱分析、PCR、RT-PCR和核酸序列测定等方法对载体组成、治疗序列、缺失片段以及其他影响治疗序列表达的重要部分进行鉴定；同时在蛋白质水平采用蛋白质电泳、免疫印迹、免疫中和试验等方法，对结构蛋白、表达产物、免疫标记、表型特征等进行鉴别。对于复合的核酸制品，应对相应的脂质等复合成分进行鉴别试验。鉴别试验应设置适宜的阳性和阴性对照。 5.2 纯度和杂质 应采用类似正交组合的方法来评估制品的纯度/杂质。 5.2.1 总纯度 适用的情况下，应采用HPLC、SDS-PAGE、紫外吸收（如A260/A280比值测定）等方法评估产品的总纯度水平。 5.2.2 工艺相关杂质 对于工艺相关杂质，应检测细胞来源的污染物的残留水平，例如来自包装细胞系或细菌的宿主细胞蛋白和宿主细胞DNA。对于生产中使用了辅助病毒、质粒DNA、牛血清、核酸酶、抗生素等的制品，还应分别检测其残留量或残留活性。如在生产中使用了其他对人体有害的试剂，如有机溶剂等，也应在制品中进行相应的检测。生产过程如使用致瘤细胞系，残留DNA水平应严格控制并保持在最低水平。经充分验证证明生产工艺对工艺相关杂质已有效控制或去除，并达到可接受的水平，相关残留物的检定项目可不列入成品的常规放行检定中。 5.2.3 制品相关杂质 对制品相关杂质的检测包括非功能形式的载体、共包装的无用基因序列等。例如，在可能的情况下，应控制病毒载体的空壳粒数和聚集体，对于质粒DNA，应控制不同质粒形式的比例等。采用复制缺陷型或条件复制型病毒载体时，应对复制型病毒或野生型病毒进行检测，且残留水平应控制在一定限度，限度标准应依据制品的非临床和（或）临床数据确定；明确具有较大临床安全性风险的，应证明制品中不存在复制型病毒或野生型病毒。 5.3 效价 根据制品特性，应至少建立一个反映疗效的生物效价指标。效价测定通常包括对基因转移效率（感染性/转导效率/传递效率）、治疗序列表达的水平、表达产物的功能或整个制品的直接活性（例如肿瘤细胞杀伤活性等）的测定。效价测定应尽可能采用定量的方法；首选体外生物效价检测方法，如体外感染、转染或转导易感细胞后，对表达产物的功能测定（如测定酶活性、细胞生长的刺激或抑制等）。当转基因表达的生物学功能表现出的活性范围过宽或仅能产生半定量甚至仅为定性结果时，可采用酶联免疫吸附法（ELISA）或其他定量方法测定治疗序列的表达水平，作为补充的效价测定方法。体外方法不可行时，可采用动物离体组织或动物体内检测方法，必要时可采用转基因动物或移植了人体组织或系统的动物。效价测定需要采用相应的活性标准品或参比品，用于计算供试品的相对效价或作为对照。 5.4 含量 根据制品组成情况，应对总颗粒数、感染性滴度或感染性颗粒数、基因组DNA/RNA或质粒DNA的量或浓度进行适宜的组合来测定原液和成品的含量，并用标准品/参考品进行比较计算或作为对照。在制品为病毒载体的情况下，还应进行总颗粒数或基因组拷贝数等物理数量与感染性滴度比例的测定和控制。 5.5 一般安全性试验 根据制品特性而定，应至少包括无菌检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查等。 5.6 其他检测项目 应根据相关制品的特性和剂型而定。检测应包括但不限于外观（例如性状、颜色）、澄清度、可见异物、不溶性微粒、pH值、渗透压摩尔浓度、装量、水分、赋形剂、粒度和粒度分布、乳光、折射率、zeta电位、包封率、释放效应等。 6 贮存、有效期和标签 制品贮存应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定，成品应在适合的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 标签应符合“生物制品分包装及贮运管理”要求和国家相关规定，标示内容至少应包括： （1）制品名称； （2）每瓶的活性单位（如必要）； （3）每瓶有效成分含量； （4）每瓶标示体积（液体制剂）； （5）批号和有效期。 |
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