1 概述 人用重组DNA蛋白制品是采用重组DNA技术，对编码所需蛋白质的基因进行遗传修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因导入适当的宿主细胞，表达并翻译成蛋白质，经过提取和纯化等步骤制备而成的具有生物学活性的蛋白质制品，用于疾病的预防和治疗。 本总论是对治疗用人用重组DNA蛋白制品生产和质量控制的通用性技术要求，具体品种还应符合本版药典各论的要求。 2 制造 2.1 基本要求 人用重组DNA蛋白制品的制造主要包括工程细胞的制备、发酵或细胞培养，目的蛋白质的提取和纯化、制剂等过程。工程细胞的来源、管理及检定应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。生产过程中使用的原材料和辅料应符合相关要求。应采用经过验证的生产工艺进行生产，并对生产工艺全过程进行控制。 2.2 工程细胞的控制 应建立细胞种子、主细胞库及工作细胞库。一般情况下主细胞库来自细胞种子，工作细胞库来自主细胞库。主细胞库和工作细胞库均应有详细的制备过程、检定情况及管理规定，并应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求。 2.2.1 表达载体和宿主细胞 应描述宿主细胞和表达载体的起源、来源、遗传背景，包括克隆基因的来源和特性、构建和鉴别情况，以及表达载体遗传特性和结构等详细资料，同时应说明表达载体来源和各部分的功能。 应详细描述表达载体扩增、对宿主细胞的转化方法、生产用细胞克隆的筛选标准及其在宿主细胞中的位置、物理状态和遗传稳定性资料。应明确克隆基因、表达载体控制区及其两侧、与表达或产品质量相关的核苷酸序列，以及在生产过程中控制、提高表达水平的各种措施。 2.2.2 细胞库系统 通常包括主细胞库和工作细胞库。主细胞库是由含目的基因表达载体转化的细胞种子经传代扩增制成的均一悬液，分装于单独容器中用于贮存。工作细胞库是从主细胞库经有限传代扩增制成的均一悬液，并分装于单独容器中用于贮存。所有的贮藏容器应在相同条件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回库内保存。 应详细记录细胞库类型、容量、预期使用频率下的寿命、保存容器、冻存剂、培养基、冷冻保存步骤和贮存条件等信息，并提供库存细胞稳定性的证据。 2.2.3 细胞库的质量控制 应对主细胞库的表型和基因型标记进行鉴定。应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因拷贝数、基因插入或缺失、整合位点数量等情况进行分析。核苷酸序列应与表达载体一致，并与所预期的表达蛋白质的序列吻合。 应对细胞库进行支原体、外源病毒因子等相关微生物污染的检测，并确认细胞基质没有被污染。已知携带内源逆转录病毒的啮齿类细胞株，如CHO细胞等，已广泛用于生产时，应采取风险控制策略，在工艺中采用物理、化学等手段对其进行去除/灭活。 主细胞库应进行全面检定，并符合要求；工作细胞库可根据主细胞库的检定情况确定应检定的项目，并符合要求。 2.2.4 细胞基质的遗传稳定性 应评估细胞基质的稳定性。应基于宿主细胞经长时间培养后表达产物分子的完整性，以及细胞基质表型和基因型特征的综合情况，确定生产用细胞的最高限定代次。 长期发酵的多次收获物会导致一些质量属性的漂移，例如糖基化等。出现的“新”的变体可能会影响制品的质量、安全和有效性。这类漂移应在工艺验证的研究中充分鉴定并明确控制策略。 2.3 生产过程的控制 生产工艺应稳定可控，并有明确的过程控制参数，以确保制品安全有效、质量可控。生产工艺的确定应建立在对目标制品的质量属性、生产工艺的深入理解和全面设计的基础上。应根据研发早期到规模化生产的整个工艺周期的相关信息，确定原液和成品生产的关键步骤并制定可接受标准进行控制，同时对其他确保工艺一致性的环节进行控制。适当的工艺过程控制能够减少对原液和（或）成品常规检测的需求。 2.3.1 细胞培养 应对生产过程中使用的各种原材料进行质量控制，以保证这些原材料符合既定用途质量标准的要求。 2.3.1.1 有限传代水平的生产 应限定生产过程中表达载体细菌或细胞传代（或细胞群体倍增）的最高次数，最高限定代次的确定应基于细胞表型、基因型特性及其所表达基因的分子完整性、一致性，以及生产末期宿主细胞/载体的一致性研究，如质粒拷贝数及其在宿主细胞内的状态，证明上述特征的试验所涉及的传代范围应等于或超过规定的细胞最高限定代次。 应根据生产过程中培养、增殖和表达量一致性的研究资料，确定终止培养、废弃培养物以及摒弃收获物的技术参数。 2.3.1.2 连续培养生产 采用细胞连续培养生产时应根据系统特点和稳定性以及培养期间产品一致性的研究资料，确定连续培养的最长周期以及培养周期全过程的监测要求，包括生产过程中制品变异体或其他培养参数未超过标准限度的数据。应对收获阶段的微生物污染进行常规检测，收获物后续加工中批次的确定应清晰并易于追溯。 应根据宿主载体系统的稳定性和制品特性等确定对细胞、制品进行再评估的时间间隔。 2.3.2 提取和纯化 制品的提取、纯化主要依赖于各种蛋白质分离技术。采用的分离纯化方法或技术，应能适用于规模化生产并保持稳定。应对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格检测，这些组分包括固定相或者流动相中的化学试剂、各类亲和色谱柱的脱落抗体或配基以及可能对目标制品关键质量属性造成影响的各种物质等。 采用细胞培养或酵母等真核表达系统时，其蛋白质产物多为分泌性蛋白质，通常只需去除细胞或酵母即可初步获得较高纯度的目的蛋白；采用大肠埃希菌等原核表达系统时，菌体裂解后应尽快进行蛋白质纯化。 纯化工艺应保证对制品中的一些特定工艺杂质，包括来自表达载体的核酸、宿主细胞蛋白质、病毒等外源因子污染，细菌内毒素以及源自培养液的各种其他残留物，必要时可采用特定的工艺将其去除或降低至可接受的水平。 生产工艺的优化应考虑残留宿主DNA片段的大小、残留量和对生物活性的影响。应采用适宜的方式将残留宿主DNA总量降至可接受的水平，并就降低残留宿主DNA片段的大小或者灭活DNA活性的方式进行说明。 对于人和动物源的细胞基质，病毒去除/灭活工艺均应充分显示能去除/灭活任何可能污染的病毒，确保原液的安全性。灭活工艺应经验证并符合要求。 2.3.3 原液 收获液经提取、纯化分装于中间贮存容器中即为原液。如需加入稳定剂或赋形剂，应不影响质量检定，否则应在添加辅料前取样进行原液检定。原液的检测项目取决于工艺的验证、一致性的确认和预期产品相关杂质与工艺相关杂质的水平。应采用适当方法对原液质量进行检测，必要时应与标准物质进行比较。原液贮存应通过稳定性验证确定贮存条件和时间。 2.3.4 半成品 可由一批或多批原液合并生产半成品。拟混合的每批原液应在有效期内且应符合拟制备制剂的有效期要求，每批原液应按规定的工艺生产、单独检验，并符合相应质量标准；不得将不合格批次与其他合格批次原液进行混合制备半成品；混合的各批原液应可有效追溯；应对混合工艺进行验证。 除另有规定外，制备成品前，如需对原液进行稀释或加入其他辅料制成半成品，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受的标准。 2.3.5 成品制剂 制剂生产应符合本版药典和中国现行《药品生产质量管理规范》的相关要求。 2.4 生产工艺变更 生产工艺变更应符合国家药品注册管理等相关要求。涉及重大生产工艺的变更，应对变更前后的制品质量、安全性和有效性进行比较和评估，以证明变更前后制品特性的高度相似，并确保任何质量属性方面的改变对制品安全性和有效性无负面影响。 3 质量控制 人用重组DNA蛋白制品的质量控制与分子大小、结构特征、质量属性复杂程度以及生产工艺相关。质量控制体系主要包括原辅料质量控制、包材、生产工艺和过程控制及制品检定等。应通过终产品检测、过程控制和工艺验证结合的方法，确保各类杂质已去除或降低至可接受水平。制品质量控制包括采用标准物质和经验证的方法评估已知和（或）潜在制品相关物质和工艺相关物质，以及采用适宜的方法对制品鉴别、生物学活性、纯度和杂质等检测进行分析。 3.1 特性分析 研发阶段以物理、化学和生物学方法对重组DNA蛋白制品的理化特性、生物学活性、免疫学特性、纯度和杂质等进行严格的特性分析鉴定是确保产品安全有效，建立并确定制品质量标准的基础。需采用广泛的分析技术来展示目标分子的理化性质（分子大小、电荷、等电点、氨基酸组成、疏水性等），以及对糖基化等各种翻译后修饰进行充分鉴定，并纳入适当的检测，以确认制品具有预期的构象、聚集和（或）降解状态及其高级结构。必要时，应采用新型分析技术用于特性分析。特性分析至少应包括以下范畴。 3.1.1 理化特性 3.1.1.1 一级结构 一级结构，即包括二硫键连接方式的氨基酸序列（包含二硫键的完整性和正确性、游离疏基）。应尽可能采用综合的方法测定目标制品的氨基酸序列，并与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较。 氨基酸序列测定还应考虑可能存在的N端甲硫氨酸（如大肠埃希菌来源的制品），信号肽或前导序列和其他可能的N端、C端修饰（如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各种其他异质性（如脱酰胺化、氧化、异构化、碎片化、二硫键错配、N-连接和O-连接的寡糖、糖基化、聚集等）。 3.1.1.2 糖基化修饰 应对糖基化修饰进行全面的分析和确定，如糖基化修饰与制品半衰期和生物学活性相关，则应确定糖的含量（如中性糖、氨基糖和唾液酸）。糖型结构可能与不良反应相关（如非人类的糖型结构或其残基），应尽可能对糖链的结构、糖型以及多肽链的糖基化位点进行深入分析。必要时应进一步就电荷异质性进行检测分析。 3.1.1.3 高级结构 应通过适合的理化方法分析高级结构，并且通过生物学功能来确认。生物学活性是对高级结构的确证，也可采用体外或体内证实其治疗功能的活性分析方法，作为高级结构确证的补充。 聚乙二醇修饰蛋白质的分析不仅限于平均修饰率，还应包括修饰位点等分析。 3.1.2 生物学活性 生物学活性测定应基于制品实现确定的生物学效应的特定能力或潜力。可采用体外或体内方法或生物化学（包括免疫化学试验）方法和（或）适宜的物理化学分析方法进行评估，如效价测定（以单位或国际单位表示）和（或）含量（以质量/重量表示）测定。 3.1.3 免疫化学特性 需全面说明制品的相关免疫学特性。应采用纯化的抗原和抗原确定的区域进行结合实验测定免疫学特性。必要时应确定亲和力和免疫反应性（包括与其他类似结构蛋白的交叉反应性）。应对目标分子中与相应表位作用的部分进行分析确证，包括对这些结构的生物化学鉴别（如蛋白质、低聚糖、糖蛋白、糖脂）和相关适合的特征研究（如氨基酸序列和糖型）。 糖基化和聚乙二醇化可能影响制品的药理学性质和免疫原性，应进行适当的特性研究。 3.1.4 纯度、杂质和污染物 生物技术制品杂质主要包括制品相关杂质、工艺相关杂质以及外源污染物。应尽可能地对杂质进行分析鉴定，并采用适宜的方法评价其对生物学活性的影响。 3.1.4.1 制品相关物质/杂质 制品相关物质/杂质主要源于生物技术制品异质性和降解产物。末端氨基酸异质性、电荷异质性、分子大小变异体以及包括糖基化在内的各类翻译后修饰等异质性（如C端加工、N端焦谷氨酸化、脱酰胺化、氧化、异构化、片段化、二硫键错配、N-连接和O-连接的寡糖、糖基化、聚集）可能导致其组成中存在几种分子或变异体，应对目标制品的各种分子变异体进行分离、鉴别和分析，如变异体的活性与目标制品一致时，可不作为杂质。但应考虑在生产和（或）贮存期间产品降解产物是否显著增加及其与免疫原性的相关性。 3.1.4.2 工艺相关杂质 工艺相关杂质包括来源于生产工艺本身，主要涉及细胞基质来源、细胞培养来源和下游工艺三个阶段。应对潜在的工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、细胞培养残留物、下游工艺的残留物等）进行鉴别、评估，并进行定性和（或）定量分析。 3.1.4.3 污染物 污染物系指所有引入且并非生产过程所需的物质（如各种微生物、细菌内毒素）。应严格避免引入污染物并对其进行相应控制。此外，还应考虑采用其他适宜检测方法，对可能污染的包括肽聚糖等在内的“非细菌内毒素促炎性污染物”进行控制。 3.1.5 含量 应采用适宜的物理化学和（或）免疫化学方法进行含量测定。以适宜的参考品为对照，蛋白质含量（以质量或重量/体积表示）可通过合适的方法进行测定（如HPLC）。蛋白质含量也能通过一个绝对定量的方法测定，可采用第二种绝对定量的含量测定方法进行溯源和验证，如果偏差太大，应考虑采用其他方法重新测定。 3.1.6 标准物质 应选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个（多个）批次，或用一个代表批次作为标准物质，用于鉴别、理化和生物学活性等各种分析，根据重组DNA蛋白制品特性，应采用现有最先进的方法对标准物质做全面深入的表征/特性分析。标准物质的建立和制备可参照“生物制品国家标准物质制备和标定”的相关要求。 用于理化测定等方面的对照品，如用于肽图或等电点测定的对照品，可用原液直接分装制得，一般-70℃以下保存。根据重组DNA蛋白制品特性应对对照品进行必要的分析鉴定，包括蛋白质含量、比活性、等电点、纯度、N端氨基酸序列、质谱分子量、液质肽图、二硫键分析、糖基分析（真核表达）等。 3.2 制品检定 应根据制品特性确定制品检定中需要进行的特性分析检测项目。建立或验证制品生产过程的有效性或可接受性的特性分析检测项目可不纳入常规质量控制中，但应对某一特定质量属性是否放入常规放行标准予以说明。 应根据一定数量的连续批次分析数据确定的批内和批间一致性分析数据，综合临床和非临床研究，以及稳定性评价数据建立制品的质量标准，包括各种分析方法及具体数值限度、可接受标准范围，以保证原液、成品或原材料在其生产的各阶段符合其预期的质量要求。可接受标准的范围确定应该考虑到所使用的分析方法的灵敏度。常规放行质量控制至少应包括以下方面。 3.2.1 鉴别 鉴别试验应高度特异，并应基于分子结构和（或）其他特有的专属性进行分析（如肽图、抗独特型免疫或其他适宜的方法）。根据制品特性，选择理化、生物和（或）免疫化学中的一种或一种以上的检测方法进行鉴别试验。 3.2.2 纯度和杂质 应采用类似正交组合的方法来评估制品纯度/杂质，并为制品相关的变异体建立单独和（或）总体的可接受标准。质量控制中包括的工艺相关杂质的质量控制（如蛋白A、宿主细胞蛋白质、DNA、其他潜在的培养或纯化残留物等）通常在原液阶段进行。如经充分验证证明生产工艺对工艺相关杂质的去除已达到高水平时，工艺相关杂质的质量控制可在恰当工艺步骤的中间产物进行，可不列入常规放行检定中。 3.2.3 效价 效价测定是以制品生物学特性相关属性为基础的生物学活性定量分析，原则上效价测定方法应尽可能反映或模拟其作用机制。比活性（每毫克制品具有的生物学活性单位）对证明制品的一致性具有重要的价值。 应采用适宜的国家或国际标准品或参考品对每批原液和成品进行效价测定。尚未建立国际标准品/国家标准品或参考品的，应采用经批准的内控参比品。标准品和参考品的建立或制备应符合“生物制品国家标准物质制备和标定”。 3.2.4 含量 采用适宜方法和参考品作为对照，测定原液和成品的含量。 3.2.5 安全性试验 应根据相关制品的各论视情况而定。检测应至少包括无菌、细菌内毒素、异常毒性检查等。 3.2.6 其他检测项目 应根据相关制品的特性而定。检测应包括外观（例如性状、颜色）、可见异物及不溶性微粒检查，溶解度、pH值、渗透压摩尔浓度、装量、稳定剂和水分测定等。 3.3 包装及密闭容器系统 应对原液和成品与容器的相容性、容器吸附、制品和包装材料之间的浸出进行检测和确认，以避免蛋白质和制剂辅料和（或）容器包装系统发生相互作用，导致对制品的安全性和有效性带来潜在风险。此外，应采用适宜方法对容器完整性进行检测，防止容器泄漏导致产品无菌状态的破坏。 4 贮存、有效期和标签 制品贮存应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定，成品应在适合的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 标签应符合“生物制品分包装及贮运管理”要求和国家相关规定，标示内容至少应包括： （1）每瓶或每1ml 的活性单位（如必要）； （2）每瓶有效成分含量和（或）蛋白质含量； （3）每瓶标示体积； （4）冻干制剂复溶液体的名称、体积及复溶后的使用期限； （5）使用前进行适量稀释（如果需要）； （6）有效期。 |
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