大肠埃希菌表达系统的工程菌含有表达目的蛋白的表达质粒,质粒上一般带有抗生素抗性基因便于筛选,在菌体传代过程中,在一定浓度的抗生素环境下(如种子培养液),质粒丢失后菌体便不能存活,而在不含抗生素的发酵培养液中,随着传代代次的提高,可能有部分大肠埃希菌丢失了质粒,失去了抗生素抗性基因,也同时失去表达目的蛋白的能力。通过比较在含有或不含抗生素培养基的菌体存活数,可以检测质粒的丢失率,考察质粒稳定性。 实际操作中一般用模拟发酵或发酵过程实时收集的发酵液,包括最后阶段(传代最多代次)的收集液,经过适当稀释后涂布于不含抗生素的培养基上,置37℃培养过夜;挑取不少于100个单菌落,分别接种到含抗生素和不含抗生素的培养皿中,置37℃培养过夜。比较两者差异,一般应重复2次以上,计算质粒丢失率。工艺验证中应规定质粒丢失率,并应在允许的范围内。 |