本品系用卡介菌经培养后，收集菌体，加入稳定剂冻干制成。用于预防结核病。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 卡介苗生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开。所需设备及器具均须单独设置并专用。卡介苗制造、包装及保存过程均须避光。 从事卡介苗制造的工作人员及经常进入卡介苗制造室的人员，必须身体健康，经X射线检查无结核病，且每年经X射线检查1~2次，可疑者应暂离卡介苗的制造。 2 制造 2.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 2.1.1 名称及来源 采用卡介菌D2 PB302菌株。严禁使用通过动物传代的菌种制造卡介苗。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。 2.1.3 种子批的传代 工作种子批启开至菌体收集传代应不超过12代。 2.1.4 种子批的检定 2.1.4.1 鉴别试验 （1）培养特性 卡介菌在苏通培养基上生长良好，培养温度在37~39℃之间。抗酸染色应为阳性。在苏通马铃薯培养基上培养的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌落，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱、微带黄色的菌膜。 （2）多重PCR法 采用多重PCR法检测卡介菌基因组特异的缺失区RD1，应无RD1序列存在，供试品PCR扩增产物大小应与参考品一致。 多重PCR鉴别试验：采用ET1（5'-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3'）、ET2（5'-CTGGCTATATTCCTGGGCCCGG-3'）、ET3（5'-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3'）三条引物，分别以灭菌超纯水稀释至终浓度为10μmol/L。DNA分子量标记物为50bp DNA ladder。 取供试品1支，加入灭菌水1ml复溶，将内容物移入1.5ml EP管中，12 000r/min，离心5分钟，弃上清，留40~50μl液体重悬供试品沉淀物，沸水浴10分钟，8000r/min离心5分钟，取上清作为多重PCR检测模板。 取供试品PCR检测模板5μl，加至45μl反应试剂中 [ 10倍PCR缓冲液（pH8.3 100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2）5μl、dNTP Mixture2μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl、引物ET1 2μl、引物ET2 4μl、引物ET3 2μl，灭菌超纯水29.7μl ] ，共50μl反应体系。检测参考品同法操作。每个供试品平行做2管。 反应体系于94℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟，64℃退火1分钟、72℃延伸30秒，循环30次后，72℃再延伸7分钟。取PCR产物10μl加6倍loading buffer [ 配方为：①吸取2ml EDTA（500mmol/L pH8.0）加入约40ml双蒸水；②称量加入250mg溴酚蓝；③量取加入50ml丙三醇；④定容至100ml，4℃保存 ] 2μl混匀后上样于3%的琼脂糖凝胶泳道，50bp DNA ladder直接上样6μl。于100mA电泳50分钟。采用凝胶成像仪，以50bp DNA ladder为分子量标记，观察供试品与参考品PCR扩增片段分子量大小。 2.1.4.2 纯菌检查 按通则1101的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。 2.1.4.3 毒力试验 用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300~400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，观察5周动物体重不应减轻；同时解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。 2.1.4.4 无有毒分枝杆菌试验 用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300~400g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只豚鼠，满3个月时解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量0.85%~0.90%氯化钠溶液混匀后，由皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。若证实属非特异性死亡，且豚鼠死亡1只以上时应复试。 2.1.4.5 免疫力试验 用体重300~400g豚鼠8只，分成两组各4只，免疫组经皮下注射0.2ml（1/10人用剂量）用种子批菌种制备的疫苗，对照组注射0.2ml 0.85%~0.90%氯化钠溶液。豚鼠免疫后4~5周，经皮下攻击103~104，强毒人型结核分枝杆菌，攻击后5~6周解剖动物，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的对数值经统计学处理，应有显著差异。 2.1.5 种子批的保存 种子批应冻干保存于8℃及以下。 2.2 原液 2.2.1 生产用种子 启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基上每传1次为1代。在马铃薯培养基培养的菌种置冰箱保存，不得超过2个月。 2.2.2 生产用培养基 生产用培养基为苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基。 2.2.3 接种与培养 挑取生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基的表面静止培养。 2.2.4 收获和合并 培养结束后，应逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜压干，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原稳定剂稀释，制成原液。 2.2.5 原液检定 按3.1项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制 用稳定剂将原液稀释成1.0mg/ml或0.5mg/ml，即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 2.4.2 分装与冻干 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。分装过程中应使疫苗液混合均匀。疫苗分装后应立即冻干，冻干后应立即封口。 2.4.3 规格 按标示量复溶后每瓶1ml（10次人用剂量），含卡介菌0.5mg；按标示量复溶后每瓶0.5ml（5次人用剂量），含卡介菌0.25mg。每1mg卡介菌含活菌数应不低于1.0×106CFU。 2.4.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 纯菌检查 按通则1101的方法进行，生长物做涂片镜检，不得有杂菌。 3.1.2 浓度测定 用国家药品检定机构分发的卡介苗参考比浊标准，以分光光度法测定原液浓度。 3.2 半成品检定 3.2.1 纯菌检查 按3.1.1项进行。 3.2.2 浓度测定 按3.1.2项进行。应不超过配制浓度的110%。 3.2.3 沉降率测定 将供试品置室温下静置2小时，采用分光光度法测定供试品放置前后的吸光度值（A580），计算沉降率，应≤20%。 3.2.4 活菌数测定 应不低于1.0×107CFU/mg。 3.2.5 活力测定 采用XTT法测定，将供试品和参考品稀释至0.5mg/ml，取100μl分别加到培养孔中，于37~39℃避光培养24小时，检测吸光度（A450），供试品吸光度应大于参考品吸光度。 3.3 成品检定 除装量差异、水分测定、活菌数测定和热稳定性试验外，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。 3.3.1 鉴别试验 3.3.1.1 抗酸染色法 抗酸染色涂片检查，细菌形态与特性应符合卡介菌特征。 3.3.1.2 多重PCR法 按2.1.4.1项进行，采用多重PCR法检测卡介菌基因组特异的缺失区RD1，应无RD1序列存在，供试品PCR扩增产物大小应与检测参考品一致。 3.3.2 物理检查 3.3.2.1 外观 应为白色疏松体或粉末状，按标示量加入注射用水，应在3分钟内复溶至均匀悬液。 3.3.2.2 装量差异 依法检查（通则0102），应符合规定。 3.3.2.3 渗透压摩尔浓度 依法测定（通则0632），应符合批准的要求。 3.3.3 水分 应不高于3.0%（通则0832）。 3.3.4 纯菌检查 按3.1.1项进行。 3.3.5 效力测定 用结核菌素皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300~400g的同性豚鼠4只，每只皮下注射0.5mg供试品，注射5周后皮内注射TB-PPD或BCG-PPD 10IU/0.2ml，并于24小时后观察结果，局部硬结反应直径应不小于5mm。 3.3.6 活菌数测定 每亚批疫苗均应做活菌数测定。抽取5支疫苗稀释并混合后进行测定，培养4周后含活菌数应不低于1.0×106CFU/mg。本试验可与热稳定性试验同时进行。 3.3.7 无有毒分枝杆菌试验 选用结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性、体重300~400g的同性豚鼠6只，每只皮下注射相当于50次人用剂量的供试品，每2周称体重一次，观察6周，动物体重不应减轻；同时解剖检查每只动物，若肝、脾、肺等脏器无结核病变，即为合格。若动物死亡或有可疑病灶时，应按2.1.4.3项进行。 3.3.8 热稳定性试验 取每亚批疫苗于37℃放置28天测定活菌数，并与2~8℃保存的同批疫苗进行比较，计算活菌率；放置37℃的本品活菌数应不低于置2~8℃本品的25%，且不低于2.5×105CFU/mg。 4 稀释剂 稀释剂为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求，灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关规定。 5 保存、运输及有效期 于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 |
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