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群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法

    药品名称: 3419 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法
    版本: 2020年版
    来源: 四部
    分类: 通则
    内容:

    分子大小测定法

    第一法测磷法(仲裁法)

    本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。

    试剂 (1)流动相 称取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g,加水使溶解成1000ml,混匀,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0。

    (2) 蓝色葡聚糖2000溶液 称取蓝色葡聚糖2000 20mg,加流动相使溶解成10ml。

    (3) 维生素B12溶液 称取10mg维生素B12,加流动相使溶解成10ml。

    色谱柱的制备 取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200ml,加流动相400ml充分搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次后,加流动相200ml,混匀,抽去凝胶中的空气,装于1.5cm×90cm色谱柱中,约87cm高,用流动相洗脱,流速为每小时15~20ml,以2~3倍柱床体积的流动相洗脱(约500ml),使柱床平衡。

    色谱柱的标定 取蓝色葡聚糖2000溶液1ml,加至已平衡的色谱柱中,以流动相洗脱,流速每小时15~20ml,用组分收集器收集洗脱液,每管收集3~5ml,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在波长260nm处测定各管洗脱液的吸光度,以吸光度为纵坐标,洗脱液体积(ml)为横坐标分别作图,波长260nm处的峰顶洗脱液体积为空流体积Vo。

    量取维生素B12溶液1ml,自“加至已平衡的色谱柱中”起,同法操作,370nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。

    测定法 取供试品约1ml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加至已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,用组分收集器收集洗脱液,每管收集5ml,照磷测定法(通则3103)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标,洗脱液体积(ml)为横坐标作图,主峰峰顶洗脱液体积为Ve。

    按下式计算∶

    式中KD为供试品分配系数;

    Ve为供试品洗脱液体积,ml;

    Vo为空流体积,ml;

    Vi为柱床体积,ml。

    计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率∶

    式中 Rx为KD值<0.5供试品的多糖回收率,%;

    Ax为供试品在KD值<0.5各管洗脱液的磷含量之和;

    At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。

    第二法仪器法

    试剂与色谱柱的制备同第一法。

    色谱柱的标定 量取蓝色葡聚糖2000溶液1ml与维生素B12溶液0.2ml,混匀后加至已平衡的色谱柱中,以流动相洗脱,流速每小时15~20ml,检测波长206nm,用组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,色谱图中,第一峰为蓝色葡聚糖2000峰,峰顶的洗脱液体积为空流体积Vo;第二峰为维生素B12峰,峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。

    测定法 取供试品约1ml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加至已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,流速为每小时15~20ml,检测波长206nm,用组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,即得。

    按下式计算∶

    式中KD为供试品分配系数;

    Ve为供试品洗脱液体积,ml;

    Vo为空流体积,ml;

    Vi为柱床体积,ml。

    计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率∶

    式中Rx为KD值<0.5供试品的多糖回收率,%;

    Ax为供试品在KD值<0.5的色谱图面积;

    At为供试品色谱图总面积。

    【附注】过柱操作在10~20℃进行。

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