第一法 亲水相互作用色谱法 本法系通过N糖苷酶F（PNGase F）对单抗N糖进行酶切，再对经酶切的N糖进行标记衍生，然后用超高效液相色谱法对单抗N糖谱进行测定。 照高效液相色谱法（通则0512）测定。 试剂 （1）N糖苷酶F（PNGase F）。 （2）2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记溶液 取350μl二甲基亚二甲基亚砜（DMSO）和150μl乙酸，混匀。精密称取25mg2-AB加入上述溶液中，充分溶解。精密称取30mg氰基硼氢化钠加入上述溶液中，充分溶解（可适当加热）。 （3）系统适用性对照品。 色谱条件 用酰胺基键合硅胶填充色谱柱，柱长150mm、内径2.1mm、粒度1.7μm，或等效色谱柱；柱温为60C，供试品保存温度为2～8℃；以50mmol/L的甲酸铵溶液（pH4.5）为流动相A液、乙腈为流动相B液，按下表进行梯度洗脱60.0分钟；荧光检测器检测，检测波长:激发波长330nm、发射波长420nm、增益10。 （2）蛋白去除和N糖的标记 向酶切完的溶液中加入三倍体积预冷的乙醇，涡旋混匀，-20℃放置1小时，沉淀蛋白。≥13 500g离心10分钟。吸取适量（如360μl）上清液至离心管中离心干燥。待完全干燥后，加入10μl 2-AB标记溶液，涡旋混匀并短暂离心，65℃下孵育2～4小时。 （3）标记的N糖纯化 釆用凝胶过滤或固相萃取，按照说明书进行操作，对标记的N糖进行纯化，以去除游离的2-AB，离心干燥纯化的样品，用100μl 170%乙腈溶液复溶。 供试品溶液的制备 参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制，但不含有单抗的溶液。参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 测定法 分别量取制备好的系统适用性对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液，注入色谱仪，记录色谱图。进样量为5μl。 进样顺序：空白对照溶液(进样1针)、系统适用性对照品溶液(至少进样2针)，供试品溶液1、供试品溶液2……系统适用性对照品溶液(至少进样1针)。 系统适用性 空白对照应无干扰峰存在，系统适用性对照品的色谱图应与参考图谱相似。 系统适用性对照品G1F(1，6)峰和G1F(1，3)峰之间的分离度不低于1.8。系统适用性对照品G0F峰面积(%)应在规定范围内(见该批次对照品说明书)。系统适用性对照品G0F峰保留时间的RSD应不高于4%(n≥3)。 结果分析 按峰面积归一化法计算，各N糖型峰面积占所有峰面积之和的百分比即为该N糖的相对百分含量。 注意事项 （1）不同品牌PNGase F的酶活性单位可能存在差异，可根据PNGase F是否能够完全酶切(如CE-SDS电泳)，调节加入的酶体积和缓冲液体系与孵育时间。 (2)本方法中描述的N糖酶切步骤适用于单抗Fc上的N糖酶切；对于在Fab上存在N糖修饰的单抗，可结合免疫球蛋白G降解酶(IdeS)酶切以及变性、还原等步骤进行处理。 (3)不同品牌荧光检测器的检测波长可能存在差异，可对检测波长进行调整(如：激发波长260nm、发射波长430nm)。对于检测器增益可进行调节，以获得合适的信号响应强度。 （4）缓冲液置换、蛋白沉淀去除以及N糖的纯化等步骤，可采用其他系统进行(如固相萃取、凝胶过滤等)，以达到等效的缓冲液置换、去蛋白沉淀和纯化等目的。根据供试品的蛋白浓度和不同的缓冲液置换方式，可对本法“系统适用性对照品溶液的制备”步骤(1)中需要置换缓冲液的供试品体积/蛋白量进行调节。 (5)高效液相色谱仪品牌不同，色谱柱的品牌/批号不同，系统适用性对照品的色谱图与参考图谱在峰型上可能略有差异。可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。 本法系通过N糖苷酶F(PNGase F)对单抗N糖进行酶切，再对经酶切的N糖进行标记衍生，然后用毛细管电泳法对单抗N糖谱进行测定。 照毛细管电泳法(通则0542)测定。 毛细管电泳系统 (1)检测器激光诱导荧光检测器。激发波长：488nm，发射波长：520nm。 (2)毛细管 涂层熔融石英毛细管(内径50μm)，切割至总长度60cm，有效长度50cm。 试剂 (1)N糖苷酶F(PNGase F)。 (2)8-氨基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(APTS)标记溶液精密称取5mg APTS，加入100μl 15%的醋酸溶液溶解，避免光照。 (3)lmol/L氰基硼氢化钠-四氢呋喃(THF)溶液。 (4)系统适用性对照品。 (5)分离缓冲液含40mmol/L 6-氨基己酸和0.2%(W/V)羟丙基甲基纤维素的水溶液，pH4.5。 系统适用性对照品溶液的制备 （1）N糖的酶切 准备30kD的超滤离心管，加入150μl的超纯水，≥13 500g离心5分钟(舍弃残留有大体积液体的超滤管，并处理新的超滤管)。加入200μl 10mg/ml的系统适用性对照品溶液至超滤管中，≥13 500g离心10分钟，丢弃下层液体。向上层截留溶液中加入400μl 10mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，≥13 500g离心10分钟，重复两次，吸取全部上层截留溶液转移至离心管中。吸取150μl 10mmol/L的PBS润洗上层超滤管，并转移至对应的离心管中(浓度约为10mg/ml)。取25μl置换PBS后的溶液，加入5μl PNGase F和70μl 10mmol/L的PBS，总体积为100μl，涡旋混匀并短暂离心，37℃水浴下孵育20小时。 (2)蛋白去除和N糖的标记 向酶切完的溶液中加入三倍体积预冷的乙醇，涡旋混匀，-20℃放置1小时，沉淀蛋白。＞13 500g离心10分钟。吸取适量(如360μl)上清液至离心管中离心干燥。待完全干燥后，加入15μl APTS标记溶液和5μl 1mol/L氰基硼氢化钠-THF，混匀并短暂离心，55℃下孵育4小时。加入500μl 水淬灭标记反应并涡旋混匀，取岀适量的溶液至样品管中进行分析。 供试品溶液的制备 参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制，但不含有单抗的溶液。参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 测定法 分离缓冲液在50psi压力下冲洗4分钟，以0.2psi压力进样纯水5秒，以0.5psi压力进样供试品10秒，29kV下分离20分钟(反相极性)。 毛细管温度：20℃。 样品盘温度：20℃。 进样顺序：空白对照溶液(进样1针)、系统适用性对照品溶液（至少进样2针），供试品溶液1、供试品溶液2……系统适用性对照品溶液（至少进样1针）。 系统适用性 空白对照应无干扰峰存在，系统适用性对照品的色谱图应与参考图谱相似。 系统适用性对照品G1F（1，6）和G1F（1，3）峰之间的分离度不低于2.0。系统适用性对照品G0F修正峰面积（%）应在规定范围内（见该批次对照品说明书）。系统适用性对照品G0F峰保留时间的RSD应不高于4%（n≥3）。 结果分析 按峰面积归一化法计算，各N糖型修正峰面积占所有修正峰面积之和的百分比即为该N糖的相对百分含量。 注意事项 （1）不同品牌PNGase F的酶活性单位可能存在差异，可根据PNGase F是否能够完全酶切（如CE-SDS电泳），调节加入的酶体积和缓冲液体系与孵育时间。 （2）本方法中描述的N糖酶切步骤适用于单抗Fc上的N糖酶切；对于在Fab上存在N糖修饰的单抗，可结合免疫球蛋白G降解酶（IdeS）酶切以及变性、还原等步骤进行处理。 （3）缓冲液置换、蛋白沉淀去除等步骤，可采用其他系统进行（如固相萃取、凝胶过滤等），以达到等效的缓冲液置换、去蛋白沉淀和纯化等目的。根据供试品的蛋白浓度和不同的缓冲液置换方式，可对本法“系统适用性对照品溶液的制备'步骤（1）中需要置换缓冲液的供试品体积/蛋白量进行调节。 （4）毛细管电泳仪品牌不同，毛细管的品牌/批号不同，系统适用性对照品的色谱图与参考图谱在峰型上可能略有差异。可对电泳条件进行适当调整。 （5）经评价和验证，可采用市售的试剂盒进行供试品制备。 照离子色谱法（通则0513）测定。 试剂 （1）N糖苷酶F（PNGase F）。 （2）系统适用性对照品。 （2）蛋白去除 向酶切完的溶液中加入三倍体积预冷的乙醇，涡旋混匀，-20℃放置1小时，沉淀蛋白。≥13 500g离心10分钟。吸取适量（如360μl）上清液至离心管中离心干燥。待完全干燥后，用100μl 0.1%三氟乙酸溶液复溶干燥后的系统适用性对照品。 （3）N糖纯化 采用凝胶过滤或固相萃取，按照说明书进行操作，对N糖进行纯化。离心干燥纯化的系统适用性对照品，用1ml纯水复溶。 供试品溶液的制备 参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制，但不含有单抗的溶液。参照本法“系统适用性对照品溶液的制备”方法进行制备。 测定法 分别量取制备好的系统适用性对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液，注入色谱仪，记录色谱图。进样量为50μl。 进样顺序：空白对照溶液（进样1针）、系统适用性对照品溶液（至少进样2针），供试品溶液1、供试品溶液2……系统适用性对照品溶液（至少进样1针）。 系统适用性 空白对照应无扰峰存在，系统适用性对照品的色谱图应与参考图谱相似。 系统适用性对照品G1F（1，6）和G1F（1，3）峰之间的分离度不低于1.0。系统适用性对照品G0F峰面积（%）应在规定范围内（见该批次对照品说明书）。系统适用性对照品G0F峰保留时间的RSD应不高于4%（n≥3）。 结果分析 按峰面积归一化法计算，各N糖型峰面积占所有峰面积之和的百分比即为该N糖的相对百分含量。 注意事项 （1）不同品牌PNGase F的酶活性单位可能存在差异，可根据PNGase F是否能够完全酶切（如CE-SDS电泳），调节加入的酶体积和缓冲液体系与孵育时间。 （2）本方法中描述的N糖酶切步骤适用于单抗Fc上的N糖酶切；对于在Fab上存在N糖修饰的单抗，可结合免疫球蛋白G降解酶（IdeS）酶切以及变性、还原等步骤进行处理。 （3）不同品牌检测器可能存在差异，可对检测器参数（电位电压等）进行适当调整，以获得合适的信号响应强度。 （4）缓冲液置换、蛋白沉淀去除以及N糖的纯化等步骤，可釆用其他系统进行（如固相萃取、凝胶过滤等），以达到等效的缓冲液置换、去蛋白沉淀和纯化等目的。根据供试品的蛋白浓度和不同的缓冲液置换方式，可对本法“系统适用性对照品溶液的制备”步骤（1）中需要置换缓冲液的供试品体积/蛋白量进行调节。 （5）离子色谱仪品牌不同，色谱柱的品牌/批号不同，系统适用性对照品的色谱图与参考图谱在峰型上可能略有差异。可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。 |
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