本品系用霍乱毒素B亚单位基因重组质粒（pMM-CTB）转化大肠埃希菌MM2，使其高效表达霍乱毒素B亚单位（CTB），经纯化、冻干制成干粉；Ｏ1群霍乱弧菌经培养、灭活、冻干制成菌粉。将两者混合后加入适宜辅料制成肠溶胶囊，用于预防霍乱和产毒性大肠埃希菌旅行者腹泻。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”及国家生物安全防护的有关规定。 2 制造 2.1 原液 2.1.1 混合前原液 2.1.1.1 霍乱菌体原液 应符合本品种附录1“霍乱菌体原液制造及检定要求”中1项的规定。 2.1.1.2 重组霍乱毒素B亚单位原液 应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中1项的规定。 2.1.2 原液检定 2.1.2.1 霍乱菌体原液 应符合本品种附录1“霍乱菌体原液制造及检定要求”中2项的规定。 2.1.2.2 重组霍乱毒素B亚单位原液 应符合本品种附录2“重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求”中2项的规定。 2.1.3 原液冻干 2.1.3.1 霍乱菌体冻干粉 将霍乱菌体原液用稀释液稀释后，冷冻干燥制成菌粉。 2.1.3.2 重组霍乱毒素B亚单位冻干粉 将重组霍乱毒素B亚单位原液用稀释液稀释后，冷冻干燥制成冻干粉。 2.2 半成品 2.2.1 配制 将霍乱菌体冻干粉、重组霍乱毒素B亚单位冻干粉与适宜辅料按一定比例混匀制成药粉，使每粒（240mg）含霍乱菌体5.0×1010个、重组霍乱毒素B亚单位1mg，用于制备胶囊。 2.2.2 半成品检定 按3.1项进行。 2.3 成品 2.3.1 分批 应符合“生物制品分包装及贮运管理”的规定。 2.3.2 分装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0103有关规定。 2.3.3 规格 每粒胶囊装量240mg，含灭活霍乱菌体5.0×1010个、重组霍乱毒素B亚单位1mg。 2.3.4 包装 应符合“生物制品分包装及贮运管理”与通则0103有关规定。 3 检定 3.1 半成品检定 微生物限度 依法检查（通则1105、1106、1107），应符合规定。 3.2 成品检定 3.2.1 鉴别试验 3.2.1.1 染色镜检 应为革兰氏阴性短小弧形杆菌。 3.2.1.2 免疫双扩散法 采用免疫双扩散法（通则3403），供试品应与兔抗CTB血清产生与对照品一致的沉淀线。 3.2.2 物理检查 3.2.2.1 外观 胶囊内药粉为淡黄色或浅褐色均匀粉末。 3.2.2.2 装量差异 依法检查（通则0103），应符合规定。 3.2.3 崩解时限 依法检查（通则0921），应符合规定。 3.2.4 干燥失重 依法检查（通则0831），胶囊内容物在80℃干烤至恒重，减失重量应不得超过5.0%。 3.2.5 重组霍乱毒素B亚单位（CTB）含量 采用免疫单扩散法测定，CTB含量应为标示量的100%～200%。 用0.9%氯化钠溶液将重组霍乱毒素B亚单位（CTB）标准品稀释至适宜稀释度，将胶囊内容物用0.9%氯化钠溶液稀释至每1ml含CTB约30μg的供试品溶液，分别加入含适量CTB抗血清的凝胶板中，置湿盒内，于37℃孵育扩散适宜时间，染色至沉淀圈显色清晰，用脱色液脱去背景颜色后，测量各沉淀圈的直径，以标准品浓度对数值为纵坐标、对应沉淀圈直径的平均值为横坐标作直线回归，求得直线回归方程。将供试品沉淀圈直径的值代入回归方程，计算供试品的浓度。 3.2.6 微生物限度 按3.1项进行。 3.2.7 免疫力试验 采用间接酶联免疫法检测免疫组小鼠血清抗体水平，与对照组小鼠血清相比较，免疫组小鼠霍乱弧菌抗体滴度应不低于对照组4倍，免疫组小鼠CTB抗体滴度应不低于对照组8倍。 取胶囊内容物，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释至每1ml含菌1.0×109个，免疫体重10～12g小鼠至少10只，每只腹腔注射2次，每次0.5ml（含菌5.0×108个），间隔7天；对照组注射液为磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。末次免疫后3～7天眼窝取血，分离血清并将免疫组各只小鼠血清和对照组各只小鼠血清分别等量混合。用含10%小牛血清和0.1%聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将上述血清分别稀释400倍待用。 将上述免疫血清稀释至适宜稀释度，以未免疫组小鼠血清为对照，采用间接酶联免疫法分别测定免疫血清中霍乱弧菌抗体和CTB抗体。计算对照组小鼠血清吸光度值的均值（X）+3倍标准差（SD），选取免疫组小鼠血清系列稀释度中吸光度值大于对照组（X）+3倍标准差（SD）的最大稀释倍数，以此最大稀释倍数除以对照组血清稀释倍数，得到免疫组小鼠抗体滴度倍数。 4 保存、运输及有效期 于2～8℃干燥保存和运输。自生产之日起，有效期24个月。 5 附录 附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求 附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求 6 使用说明 应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。 附录1 霍乱菌体原液制造及检定要求 本品系用Ｏ1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌经培养、加入甲醛溶液杀菌后冻干制成，用于制备重组B亚单位/菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 1.1.1 名称及来源 采用霍乱弧菌Ｏ1群古典生物型16012菌株或Eltor生物型18001菌株。来源于中国医学细菌保藏管理中心。 1.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 1.1.3 种子批的传代 主种子批菌种启开后传代次数不得超过5代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过5代。 1.1.4 种子批的检定 主种子批应进行以下各项全面检定，工作种子批应进行1.1.4.1～1.1.4.3（1）项检定。 1.1.4.1 培养特性及染色镜检 将待检菌种接种于pH7.8～8.2的肉汤琼脂或其他适宜培养基，置37℃培养18～24小时，应为光滑、半透明的圆形菌落。涂片染色镜检应为革兰氏阴性短小弧形杆菌。 1.1.4.2 生化反应 发酵甘露糖和蔗糖，产酸、不产气；不发酵阿拉伯糖。 1.1.4.3 血清学试验 （1）玻片凝集试验 用特异性血清做玻片凝集试验时，应与本型血清相凝集。 （2）定量凝集试验 用霍乱弧菌Ｏ多价诊断血清（原效价不低于1∶640）与18～24小时的Ｏ1霍乱弧菌培养物以0.85%～0.90%氯化钠溶液稀释成细菌悬液（每1ml含菌1.8×109左右）进行定量凝集试验，凝集效价应不低于原血清效价之半。 1.1.4.4 毒力试验 将37℃培养8～16小时的培养物刮入30.0g/L碱性蛋白胨水中，比浊后用胃膜素或其他适宜稀释液稀释成不同浓度的菌悬液。每个浓度的菌悬液用体重18～20g小鼠5只，每只腹腔注射0.5ml，观察3天。计算LD50应不超过2×108个菌。 1.1.4.5 抗原性试验 选体重约2.0kg的家兔3只，静脉注射菌悬液3次，每次0.5ml，第一次注射含菌1.0×109，第二次注射含菌2.0×109，第三次注射含菌3.0×109，每次间隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集试验，2/3家兔血清之凝集效价达到1∶2000（+）即为合格。 1.1.5 种子批的保存 原始种子批和主代种子批应冻干保存于室温。工作种子批为半固体穿刺管室温保存，保存时间24个月。 1.2 原液 制造霍乱疫苗应用Ｏ1群古典生物型或Eltor生物型霍乱弧菌（根据流行情况确定）。 1.2.1 生产用种子 启开工作种子批菌种，接种于LB培养基上，制备生产用工作种子。 1.2.2 生产用培养基 采用适宜的培养基。生产用培养基不得含有使人产生毒性反应或变态反应的物质。 1.2.3 培养收获 1.2.3.1 培养 采用适宜方式培养，在培养过程中取样进行纯菌检查、涂片革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。 1.2.3.2 纯菌检查 培养物涂片进行革兰氏染色镜检，应为革兰氏阴性短小弧形杆菌。若镜检发现有杂菌生长，应废弃。 1.2.3.3 杀菌 加入终浓度不超过1%（ml/ml）的甲醛溶液，于37℃杀菌2～3天。 1.2.3.4 杀菌检查 纯菌检查合格的菌液，应取样接种不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基、胰酪大豆胨琼脂斜面及碱性琼脂斜面各1管，于37℃培养5天，若有菌生长应废弃。 1.2.3.5 收获 采用超滤或其他经批准的工艺进行菌体收获和保存。 2 原液检定 2.1 染色镜检 应为典型革兰氏阴性短小弧形杆菌。 2.2 凝集试验 与霍乱弧菌Ｏ多价诊断血清做玻片定性凝集试验，呈阳性反应。 2.3 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。另加试1%碱性蛋白胨水培养基1管，于30～35℃培养，应无菌生长。 2.4 浓度测定 按“中国细菌浊度标准”测定，每1ml含菌应为5.0×1011～1.05×1012。 2.5 游离甲醛残留量 每5.0×1010菌中含游离甲醛不高于0.16mg（通则3207第一法）。 2.6 霍乱毒素残留量 采用间接ELISA法检测霍乱毒素（CT）残留量，每5.0×1010菌中含霍乱毒素不高于10mg。 以神经节苷脂（GM1）包被，用适宜稀释液将霍乱毒素对照品和供试品稀释至适宜浓度测定。以对照品溶液吸光度对其相应的浓度进行四参数方程拟合，将供试品吸光度值代入四参数方程拟合，得到供试品中CT含量。 3 保存及有效期 于2～8℃保存，自收菌之日起保存时间不超过6个月。 附录2 重组霍乱毒素B亚单位原液制造及检定要求 本品系由大肠埃希菌重组表达的霍乱毒素B亚单位（CTB），经纯化、冻干制成；用于配制重组B亚单位/菌体霍乱疫苗（肠溶胶囊）。 1 制造 1.1 菌种 1.1.1 名称及来源 重组霍乱毒素B亚单位表达菌株为大肠埃希菌工程菌株。 1.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的有关规定。 1.1.3 种子批的传代 主种子批菌种启开后传代次数不得超过5代；工作种子批菌种启开后至接种生产用培养基传代次数不得超过5代。 1.1.4 种子批的检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 1.1.4.1 培养特性 应呈典型大肠埃希菌集落形态，无其他杂菌生长。 1.1.4.2 染色镜检 应为典型的革兰氏阴性杆菌。 1.1.4.3 对抗生素的抗性 在含氨苄西林为50μg/ml的培养基上正常生长。 1.1.4.4 电镜检查（工作种子批可免做） 应为典型的大肠埃希菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。 1.1.4.5 生化反应 应符合大肠埃希菌生物学性状。 1.1.4.6 重组霍乱毒素B亚单位表达量 用适宜的液体培养基培养后，获得的培养物上清液采用间接ELISA法检测，以神经节苷脂（GM1）包被，以兔抗CTB血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为二抗。检测结果应为强阳性，P/N值应大于10。 1.1.4.7 质粒检查 用适宜方法提取工程菌质粒DNA，经酶切后，采用琼脂糖凝胶电泳分析，电泳图谱应与原始重组质粒的酶切图谱相符。 1.1.4.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 1.2 原液 1.2.1 生产用种子 启开工作种子批菌种，经适当传代、取样经培养特性检查及染色镜检合格后接种于培养基上，制备数量适宜的生产用种子。 1.2.2 生产用培养基 采用不含抗生素的适宜培养基。 1.2.3 接种和培养 采用培养罐液体培养，可用适宜的诱导剂诱导目标蛋白产生。 1.2.4收获 发酵液经离心，去除菌体，收集上清液。 1.2.5 纯化 采用柱色谱方法或其他批准工艺，纯化目标蛋白，并经超滤浓缩至适宜浓度。 1.2.6 除菌过滤 将CTB浓缩液进行除菌过滤，分装于适宜容器中，即为CTB原液，于2～8℃保存。 2 原液检定 2.1 CTB含量 用0.9%氯化钠溶液将原液稀释至每1ml含CTB约30μg，按正文3.2.5项进行，CTB含量应不低于0.7mg/ml。 2.2 电泳纯度 依法测定（通则0541），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于2.5μg（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 2.3 分子量 依法测定（通则0541），用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶的胶浓度为15%，加样量应不低于0.5μg，分子质量应为11.6kD±1.2kD。 2.4 抗生素残留量 依法检查（通则3408），不应有残余氨苄西林活性。 2.5 等电点 依法测定（通则0541），主区带等电点应为7.2～8.2，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致。 2.6 紫外光谱 依法检查（通则0401），在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为279nm±3nm。 2.7 肽图 按以下方法测定，应与对照品图谱一致。 取供试品适量，用醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.8）制成每1ml含4mg的溶液，于25℃放置72小时。取此液50μl，加Tris溶液（pH 10.9）150μl、Tris-醋酸缓冲液（pH 8.5）100μl、胰蛋白酶溶液适量，混匀。置37℃水浴24小时后，加40μl冰醋酸终止反应，以每分钟10000转离心3分钟，依法测定（通则3405）；其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温为45℃，流速为每分钟0.5ml。按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸的水溶液，B为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液）。 2.8 无菌检查 依法检查（通则1101），应符合规定。 2.9 N端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr-Asp-Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-Thr 3 保存及有效期 于2～8℃保存，原液自采集之日起保存时间不超过6个月。 |
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